[发明专利]分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法

说明书

本发明公开了一种分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法，包括如下步骤：用洗脱液平衡色谱柱后，将含有白蛋白结合物和非结合的小分子化合物混合溶液上样至色谱柱；用洗脱液冲洗色谱柱，当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集含白蛋白结合物的冲洗液，当UV吸光度降至基线水平时停止收集；用纯化水冲洗色谱柱，当含游离的小分子化合溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含游离小分子化合物的冲洗液，当UV吸光度降至基线水平时停止收集。从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离游离小分子化合物，具有分离效果好，处理批量大的优点。解决了不能去除游离小分子化合物的缺点，克服了采用凝胶过滤层析方法处理批量小的缺陷。

技术领域

本发明涉及用于从含有白蛋白非结合物及白蛋白结合物溶液中分离白蛋白非结合物及白蛋白结合物和游离小分子化合物的方法。

背景技术

白蛋白本身具有可生物降解、无毒、无抗原性、病人耐受和生物利用度高等特点，因此白蛋白受到生物医药领域的广泛关注。其中白蛋白载药技术应用比较广泛和成熟，白蛋白载药体系可改善药物的药代动力学特征，如延长药物半衰期，增强药物活性等。目前，已有多个药物采用相关技术上市，比如白蛋白纳米紫杉醇，索玛鲁肽等。

Conjuchem公司的药物亲和构建技术平台技术也是一种采用白蛋白偶联药物的技术平台，该平台是对母体药物进行结构修饰后与白蛋白的34位半胱氨酸残基（巯基）反应，由于并不是所有的白蛋白分子都含有34位半胱氨酸残基（巯基），因此在白蛋白和修饰后的小分子化合物耦合后需要去除未反应的游离白蛋白。CN1956998A 描述了纯化白蛋白结合物的方法，具体为一种用于通过疏水作用层析从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离白蛋白结合物的方法。CN1956998A具体是将含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液加样到用高含盐量的水性缓冲液平衡的疏水性填料上，通过降低盐的浓度梯度洗脱实现把含有白蛋白结合物与非结合白蛋白分离。

在白蛋白和小分子化合物结合反应后，除含有非结合白蛋白外，还会含有非结合的游离小分子化合物。CN1956998A只是有效地把白蛋白结合物和非结合物进行了分离，并不能把未反应的游离的小分子化合物去除。在含有小分子化合物的白蛋白溶液中，白蛋白的分子量是小分子化合物分子量的十几倍，因此本专业人员在分离小分子化合物时通常会根据分子量的较大差异，采用凝胶过滤层析的方法进行纯化，比如GE公司的superdex75或superdex200填料，采用凝胶过滤层析的方法虽然可以实现有效分离，但该采用该技术的缺点是上样量小，处理批量小。

发明内容

本发明提供一种用于从含有白蛋白非结合物及白蛋白结合物的溶液中将白蛋白非结合物及白蛋白结合物与非结合的小分子化合物分离的方法，以解决现有技术存在的问题。

为实现本发明目的，这种分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法，其特征在于包括如下步骤：

a. 用洗脱液平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱后，将含有白蛋白结合物和非结合的小分子化合物混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱；

b. 用洗脱液持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱，当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集含白蛋白结合物的冲洗液，当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集；

c. 停止收集白蛋白结合物后，再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱，当含游离的小分子化合溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含游离小分子化合物的冲洗液，当含游离小分子化合物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集。

所述洗脱液由磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠组成，所述洗脱液pH值为6.0，所述磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠之间的摩尔比为20:1～10:5。

所述小分子化合物为GLP-1类似物或胰岛素。