[发明专利]一种胰岛β细胞体外制备方法

权利要求书

1.一种胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：该方法为外泌体连续孵育诱导干细胞分化方法；所述干细胞为人iPSCs；所述外泌体来源为成熟胰岛β细胞；所述外泌体中产生功能的因素为miR-212/132；所述miR-212/132具有促进iPSCs向胰岛β细胞定向分化的功能；

包括以下步骤：

(1)外泌体提取

应用血清替代物替代培养基中的血清，体外培养人胰岛β细胞，细胞培养过程中每隔两天收集培养上清，使用超速离心法分离细胞培养基中的外泌体；

(2)外泌体电镜观察

(3)Western blotting分析外泌体标志物的表达

(4)外泌体诱导iPSCs定向分化

①收集获得的外泌体采用蛋白的BCA法计算浓度，采用收集的外泌体对iPSCs进行定向诱导，外泌体诱导剂量按照蛋白浓度计算，每微升培养基中需添加0.2微克外泌体；

②加入iPSCs培养基中连续诱导10天，对所分化细胞进行β细胞标志物表达初步分析，包括免疫荧光和流式细胞术分析β细胞标志物的表达；

(5)β细胞功能验证

①分别采用两种不同浓度葡萄糖的刺激液，刺激液A 5.5mM和刺激液B20.5mM；具体操作：弃原诱导液，PBS洗2次，加入不含血清的刺激液，2h后分别收集培养液，利用ELISA方法检测胰岛素的分泌表达；

②分别收集3×10⁶分化的β细胞注射到4周龄免疫缺陷小鼠肾包膜下；2周后，按照2g/kg体重腹腔内注射D-(+)-葡萄糖，分别在注射前0min和注射后30min，使用高敏感ELISA试剂盒检测小鼠血清中人胰岛素的水平；并对比表达量的变化；

(6)胰岛β细胞外泌体miRNA功能验证

①验证外泌体中miRNA在β细胞分化中的作用，对Dicer酶进行shRNA设计，筛选有效的shRNA敲减Dicer表达，阻断pre-miRNA的有效剪切，降低mature miRNA的表达量；筛选有效的shRNA并通过慢病毒载体侵染iPSCs，进行外泌体孵育法定向诱导其分化，流式细胞术分析β细胞分化效率变化；其中shRNA序列如序列表中SEQ ID No:1所示；

②利用miRNA microarray检测iPSCs、β细胞及其外泌体中miRNA的表达，对比分析两种细胞及其外泌体中miRNA的表达特征，real time-PCR验证miRNA microarray的实验结果，分析差异显著且与胰岛发育相关的特异miRNA。

2.根据权利要求1所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将要提取的细胞培养上清液10ml，在4℃的环境下，300g 10min，2000g 20min，弃沉淀，去除细胞，然后10,000g 30min，弃沉淀，去除亚细胞成分，再用10,000g 60min，弃掉上清液，最后所得沉淀即为外泌体。