[发明专利]一种利用家蚕生产蜘蛛丝的方法

说明书

本发明公开了一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法，包括如下步骤：1)在家蚕的丝素重链基因FibH上选择TALENs的两个靶点；2)分别构建用于表达TALENs的质粒；3)体外转录TALENs mRNA；4)构建包含蜘蛛丝基因MaSp1的donor载体；5)将TALENs mRNA和donor载体混合，对家蚕进行显微注射，注射后的蚕卵进行催青直到孵化，饲养出生产蜘蛛丝蛋白的家蚕个体。实验表明饲养孵化出来的G1代蚕卵中蜘蛛丝MaSp1基因替换了家蚕FibH基因，饲养的家蚕个体分泌出了蜘蛛丝，突破了传统转基因家蚕不能在家蚕丝腺中大量合成蜘蛛丝蛋白的限制。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用家蚕生产蜘蛛丝的方法，尤其涉及一种利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法。

背景技术

家蚕(Bombyx mori)是一种绢丝昆虫，属于鳞翅目昆虫，也是一种模式生物。经过数千年的驯化和改良，家蚕已经成为我国最为重要的经济昆虫并支撑着蚕丝行业。家蚕幼虫期大量摄食桑叶，在丝腺中合成并分泌蚕丝蛋白，幼虫末期经吐丝结茧形成蚕丝。蚕丝不仅可以作为纺织业的原材料，在化工、医学以及食品工业等领域也发挥着重要作用，是我国一些地区的重要支柱产业。我国蚕丝生产历史悠久，规模庞大，近年来，丝绸行业的总产值高达两千亿元。此外，由于具有劳动密集型的特点，蚕丝行业为我国大量的农业劳动力创造了工作机会，帮助国家解决了就业问题。随着我国家蚕基因组计划宣布家蚕基因组框架图的完成，标志着家蚕后基因组时代的到来，功能基因组学的主要工作包括：大量功能基因的克隆鉴定、重要生物学性状的分子调控机理，以及实现人为控制和调节这些基因和性状以满足人类的需求。

蜘蛛丝目前算得上是自然界中最结实、最具有延展性的材料。蜘蛛丝的理化性质与蚕丝相比，具有非常明显的优势。在力学强度方面，蜘蛛丝纤维与强度最高的碳纤维及高强合纤Aramid、Kelve等强度相接近，但它的韧性明显优于上述几种纤维。因此，蜘蛛丝纤维在国防、军事(防弹衣)、建筑等领域具有广阔应用前景。天然蜘蛛丝主要来源于结网，产量非常低，而且蜘蛛具有同类相食的个性，无法像家蚕一样高密度养殖。所以要从天然蜘蛛中取得蛛丝产量很有限。随着现代生物工程发展，用基因工程手段人工合成蜘蛛丝蛋白是一种新突破，有可能形成具有远大前景的蜘蛛丝产业。由于家蚕是吐丝昆虫，其作为表达蜘蛛丝蛋白的表达宿主是不二选择。

基因组编辑技术是进行功能基因组研究的重要工具，锌指核酸酶技术(ZFNs)、类转录激活因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs，转录激活子样效应因子核酸酶)技术以及CRISPR/Cas9技术是近年来发展起来的三种主流基因组编辑技术。这三种基因组编辑技术的原理都是通过在生物基因组特定位点制造DNA断裂损伤，从而激活机体自身的DNA损伤修复机制，在此过程中引发各种变异。目前，三种技术都在多种物种中成功应用。在昆虫中，基因组编辑技术首先在果蝇中得以开展。2002年，Bibikova等人使用ZFNs技术在基因组水平上成功地将果蝇的yellow基因敲除。2010年Takatsu等人使用ZFNs技术在家蚕基因组水平上敲除了BmBLOS2基因，突变个体变现出油蚕表型，并且这种变异成功遗传到下一代。2012年Ma等人使用TALENs技术敲除了家蚕BmBLOS2基因，突变个体表现出油蚕表型，同时还使用两组TALENs在两个位点切割，造成了靶标位点中间片段的缺失。Wang等人在家蚕中成功建立起CRISPR/Cas9基因组编辑技术平台以及基于TALEN的基因敲入技术。这些研究进展预示着家蚕具有生产蜘蛛丝蛋白的可能性。但是，迄今尚未有通过在家蚕中用蜘蛛丝基因替换丝素基因进行蜘蛛丝生产的报道。

发明内容

为了解决了这一瓶颈，扩展家蚕的应用领域，保持蚕业的可持续发展，创造了利用非转基因方式的利用家蚕生产蜘蛛丝蛋白的方法，利用该方法可以大量表达外源蛋白。