[发明专利]一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒

说明书

本发明公开了一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。本发明用于构建转录组测序文库的接头序列，巧妙的应用了以C3～C21长碳链的化学修饰，应用于单链形成的茎环结构测序接头，与现有的主流建库接头相比，有不易产生接头二聚、无需额外进行双链退火和无需使用酶打开茎环中环状结构的优势，在不影响后期PCR扩增的基础上，大大的节省了反应时间和试剂成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒。

背景技术

随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序已经成为研究基因表达与转录调控的重要手段。转录组是指单个生物物种的个体，或者该个体的特定组织或特定细胞类型，在特定的环境条件下，或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。各种类型的转录本都可以通过新一代测序技术进行高通量定量检测，这项技术被称为转录组测序。转录组测序技术可以用作转录本的结构及其变异、基因表达水平、非编码区域功能和低丰度全新转录本发现等各方面的研究上。通过对转录组的研究，人们能够从生物的整体水平上研究基因结构及其基因功能。转录组测序已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等领域中。

转录组文库构建常规流程包括：1)总RNA的分离和纯化，富集mRNA 或者去除核糖体RNA(rRNA)；2)富集后的RNA进行打断；3)第一链cDNA 反转录；4)第二链cDNA合成；3)双链cDNA片段末端补平；4)双链cDNA 片段3’端加A尾；5)双链cDNA片段加接头；6)选择双链cDNA片段大小；7)PCR扩增；8)检测转录组文库的质量。转录组建库常用试剂为NEB Ultra系列、Illumina Truseq系列及Kapa Hyper系列等，而建库试剂中的接头主要有三种经典结构，包括平端双链接头(以Thermo公司的建库试剂为代表)、Y型结构双链接头(以Illumina公司的建库试剂为代表)和U型结构单链接头(以NEB公司的建库试剂为代表)。这三种接头的主要优势和弊端分别为，平末端的双链接头效率中等，易形成接头自连；Y型结构双链接头连接效率偏低，制作工艺需要额外添加退火步骤，而且退火前两条单链的浓度及比例常因为定量问题而存在批次间产生比例失衡而不稳定；U型结构单链接头由于为单链结构，天然形成部分双链的茎环结构，无需额外退火，连接效率高，不易产生接头自连，但是需要在文库PCR扩增之前使用酶把 U型结构打开，增加实验的步骤及试剂成本。现阶段所有的接头设计序列上仍然受到测序上游公司的制约，而设计出连接效率高、最终文库得率高且步骤简单节省试剂成本的接头，将有利于进一步降低基因组测序文库构建成本，推动基因测序的不断发展。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于构建转录组测序文库的接头序列，其中，所述接头序列的5’端用磷酸修饰，且靠近5’端的GATCGGAAGAGC与靠近3’端的CGACGCTCTTCCGATC形成双链茎结构，其余碱基形成环状结构； 3’端最后一个碱基为T，并以硫代修饰。

需要说明的是，本发明接头序列中，所述环状结构至少包含2个碱基，其中间还以C3(3个连续碳链)～C21(21个连续碳链)修饰。

作为一种优选技术方案，所述环状结构上的碱基为39个，其中间以1～3个 C18(18个连续碳链)修饰。

作为一种最优选技术方案，所述环状结构由19个碱基+C18+20个碱基构成。

本发明另一目的是提供一种构建转录组测序文库的方法，其包括如下步骤：

S1、提取样品的总RNA，或进一步经mRNA富集，或去rRNA处理后得到的RNA，进行反转录，形成双链cDNA；