[发明专利]一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法

权利要求书

1.一种基于转录测序获得青篱柴SSR引物的方法，包括以下步骤：

（1）取贵州省黔东南苗族侗族自治州的青篱柴作为样品，将同一株青篱柴根、茎、叶3种组织做转录组测序；

（2）分析不同类型SSR重复单元的重复次数分布，利用MISA软件对青篱柴转录组测序后组装出的Unigene序列进行SSR位点检测和分析，筛选SSR位点，搜索设置为单核苷酸重复至少10次，二核苷酸重复至少6次，三至六核苷酸重复至少5次；

（3）采用Primer 3.0引物批量设计程序对SSR位点的两端序列进行引物设计；

（4）利用植物基因组DNA提取试剂盒提取采自黔南布依族苗族自治州不同地理位置的20份青篱柴样品的DNA；

（5）根据引物设计原则，利用Primer Premier 5.0对（3）中已设计好的引物进行进一步筛选，最终选取50对引物序列送至公司进行合成，引物合成后进行PCR扩增；

（6）采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性引物，根据电泳检测显影结果，分析其多态性。

2.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述转录组测序中：转录组测序时所使用的是青篱柴根、茎和叶片3种组织的混合RNA。

3.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所述转录组测序的具体步骤如下：采用全能型植物RNA提取试剂盒（OminiPlant RNA Kit）分别提取青篱柴根、茎和叶片的总RNA，纯化分离总RNA中的mRNA，以mRNA为模板合成双链cDNA，双链cDNA进行末端修复补平，加A尾并连接测序接头，最后进行PCR扩增，得到符合测序要求的文库，用Illumina HiSeqTM2000对扩增后的文库进行检测，使用Trinity软件组装测序数据得到Unigene。

4.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤（2）中所述利用MISA软件对青篱柴转录组测序后组装出的Unigene序列进行SSR位点检测和分析，检测中对应的单核苷酸至少重复10次，二核苷酸至少重复6次，三至六核苷酸至少重复5次，同时筛选被间隔小于或等于100bp碱基打断的复合型SSR。

5.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤（3）中所述对SSR位点两端序列进行引物设计的参数标准如下：Tm55-64℃，上、下游引物的Tm值相差小于5℃，引物长度为18-27bp，产物大小为10-300bp，GC含量为40%-60%，选取引物50对，尽量避免出现引物二级结构。

6.根据权利要求1所述的一种基于转录组测序获得青篱柴SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤（5）中所述扩增所用的反应体系为Template DNA（50ng/ul）1ul，2x MasterMix（Promega）10ul，Forward primer（10uM/ul）0.5ul，Reverse primer（10uM/ul） 0.5ul，dd H2O 2ul，反应过程中，94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40 s，36次循环，再72℃延伸7 min，得到扩增产物，放于4℃保存。