[发明专利]一种腺病毒载体及其构建方法

说明书

本发明公开了提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法。该方法为将pRed/ET(Δα)电转到含有pAV.Des1d载体的DB3.1感受态中，用一个包含同源臂的Kan抗性片段进行同源重组，通过连续抗性压力下筛选出只具有Amp+Kan抗性，而没有Amp+Cm抗性的阳性克隆。第二步重组用带同源臂的attR4‑Cm‑ccdB‑attR2或attR4‑Cm‑ccdB‑attR3进行重组，再利用抗性筛选出只具有Amp+Cm抗性，而没有Amp+Kan抗性的正确的阳性克隆，从而得到本发明腺病毒载体。本发明腺病毒表达载体，且具有很好的准确性、高效性，成功率高。大大降低了人力时间成本，提高了用户体验。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种腺病毒载体及其制备方法。

背景技术

腺病毒是一种无包膜的线性双链DNA病毒，广泛存在于大自然中，其基因组全长约36kb。腺病毒对大多数细胞有几乎100％的感染效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。由于腺病毒基因组不整合到宿主的基因组，所以腺病毒在宿主体内是瞬时表达。腺病毒可以直接感染动物个体，通常用于疫苗和基因治疗。由于以上种种优点，腺病毒载体是一种应用较为广泛的病毒载体系统，其中使用最广泛的是5型血清型腺病毒载体。为了提高腺病毒载体的生物安全性，人们对腺病毒基因组进行改造，构建出缺失了腺病毒的早期表达基因序列E1和E3区的重组腺病毒载体。E1是腺病毒复制所必须的，E1的缺失使其不能自身复制，只能依靠包装细胞如293A细胞提供的反式互补进行复制扩增，而不能进行自主复制，E3基因表达的蛋白能对抗宿主的抗病毒防御系统，E3区的去除能减少宿主的体液免疫反应。

Gateway技术是基于λ噬菌体位点专一重组系统的一种通用的克隆技术，能够快速地高特异性地将异源DNA片断克隆到不同的载体中。其特点是通过BP反应和LR反应最终把目的基因克隆到表达载体上。在Gateway技术中起到重组作用的是重组位点：attB,attP,attL和attR。在BP Clonase^TMII enzyme mix催化的重组反应中，attB位点通常与attP位点发生重组。BP重组反应(BP recombination)是指含有attP位点的供体载体(donor vector)与含有attB位点的PCR产物或者其它克隆之间的att位点序列交换反应。供体载体携带卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和一个ccdB自杀基因。氯霉素抗性基因和ccdB自杀基因位于两个attP位点之间。由于ccdB自杀基因只能存在于ccdB T1surviral cells、ccdB T2surviral cells或者DB3.1中，而对Top10、stbl3、DH5a这些细胞具有致死作用。若要复制供体载体，必须把供体载体转化到ccdB T1surviral cells、ccdB T2 surviral cells或者DB3.1里才能随着宿主分裂而复制。BP重组反应的结果是attB-PCR产物中的目的序列交换到含有attP位点的供体载体内，而供体载体内的ccdB自杀基因和氯霉素抗性基因交换出去。BP重组反应产物被转化到非ccdB surviral cells内，如Top10，再用含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。基于卡那霉素和自杀基因的双重筛选，90％的克隆都是正确的克隆。attB和attP位点重组后，序列发生交换，导致重组后的含有目的序列的供体载体上的attP位点序列产生了变化，attP位点变成成attL位点。一般将重组后的供体载体称为入门克隆(entry clone)。