[发明专利]血浆中游离DNA的保护剂

说明书

本发明涉及血浆中游离DNA的保护剂，属于生物技术领域。血浆中游离DNA的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：50‑600g/L的防腐剂、30‑100g/L的核酸酶抑制剂、20‑200g/L的代谢抑制剂、和1‑120g/L的防吸附剂。将采集的血液与保护剂按照5‑1000：1的比例混合，在常温条件下能够保护血液游离DNA长达14天，在37度下能够保护血液游离DNA长达4天，能够保护血液游离DNA连续运输两天。本发明通过优选各组分及其含量，可以有效的保存和提取血液中的游离核酸，同时避免在抽取血液后由于血细胞的裂解而掺入血细胞中的核酸。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种血液中游离DNA的保护剂。

背景技术

近年来，随着测序技术的高速发展以及国家一系列利好政策的推动，以血浆中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)为研究对象的无创产前诊断和肿瘤液体活检产业蓬勃发展。由于血浆内胎儿DNA和循环肿瘤DNA(irculating tumor DNA，ctDNA)含量较低，低频突变或超低频突变的检测仍困难重重。

在母亲血浆中，单胎妊娠早期的胎儿释放的游离cfDNA浓度小于10％。随着保存时间的延长，白细胞降解及随之而来的母体基因组DNA(gDNA)的释放将严重影响低含量的胎儿游离DNA的比例及完整性。对于循环肿瘤DNA而言，这一问题更为突出。在癌症早期，突变等位基因的频率(mutant allele frequencies,MAFs)可能低至1/10,000。cfDNA样本本身在保存过程中如果被“背景”gDNA干扰，会造成检测灵敏度的大幅度降低以及大量数据的浪费。因此如何稳定血浆中的白细胞，降低其在保存过程中因降解而释放大量gDNA造成的“污染”，是液体活检的重要一环。

对于cfDNA的保存，利用超高速离心分离血浆是最直接有效的避免白细胞gDNA干扰的方法。但是实际样品采集中，往往不具备高速离心和冷冻保存的条件。游离核酸采血管便在这种情况下应运而生。这些保存管的目的就是尽可能长时间的在常温状态下保存血浆中的游离核酸。目前商业化的游离核酸采血管，有些利用甲醛等交联剂稳定白细胞减缓背景gDNA的释放。但是这些交联剂会损伤cfDNA，并且会降低测序检出率。

因此，研制“采样、保存、运输”为一体的新一代游离核酸采血管，其特有的超长期保存和有效抑制背景gDNA污染将进一步解决现有cfDNA样本保存的难点问题，方便了样本储存和运输，简化了临床实验室的运作。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供一种新型保存剂，能够高效固定血液细胞，不但保护血液中cfDNA的稳定性，而且长时间防止血液细胞破裂，避免基因组DNA释放造成对cfDNA的污染，可以确保低频突变的有效检出。

血浆中游离DNA的保护剂，是以下组分的无菌水溶液：50-600g/L的防腐剂、30-100g/L的核酸酶抑制剂、20-200g/L的代谢抑制剂、和1-120g/L的防吸附剂。

所述防腐剂为下列中的一种或几种：DTT、NaF、DU、恶唑烷、羟甲基甘氨酸钠、IDU、ATA、草酸钠。优选：DU和IDU，或其它化合物与它们的组合。

所述核酸酶抑制剂为下列中的一种或几种：ATA、EDTA、DTT、甲酰胺、酒精、蛋白酶K、肝素、半胱氨酸、二价阳离子化合物，所述二价阳离子为下述金属二价阳离子Mg,Mn,Zn，Fe，Ca，Cu。优选：EDTA。

所述代谢抑制剂为下列中的一种或几种：草酸钠、氟化钠、甘油醛、丙酮酸盐、磷酸烯醇丙酮、草酸钾、磷酸烯醇丙酮酸盐。优选：氟化钠和甘油醛。

所述防吸附剂为下列中的一种或几种：聚乙烯醇，甜菜碱，海藻糖，吐温20。优选聚乙烯醇和海藻糖，或者吐温20与它们的组合。