[发明专利]一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法及细菌鉴定试剂盒

权利要求书

1.一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、选取待鉴定的细菌菌株，并提取和纯化所述菌株的基因组DNA；

步骤二、采用扩增引物PCR扩增步骤一中纯化后的基因组DNA的特征序列片段；

步骤三、提取和纯化步骤二中获得的PCR扩增产物；

步骤四、测定步骤二中纯化后的PCR扩增产物的序列，并采用通用性序列拼接软件，去除引物区，获得相应片段的DNA序列；

步骤五、将步骤四所述的相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定；

其中，所述步骤一中，菌株的基因组DNA的提取和纯化采用溶菌酶、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵进行菌体破碎；采用苯酚-氯仿-异戊醇、乙醇沉淀核酸，获得符合质量控制要求的基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml～20mg/ml溶菌酶、5％～10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％～10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。

3.根据权利要求2所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌体破碎过程中各试剂的浓度为10mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者10mg/ml溶菌酶、10％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、10％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液；或者20mg/ml溶菌酶、5％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液、5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵溶液。

4.根据权利要求3所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化包括如下步骤：

取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入适宜的缓冲液、溶菌酶，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈震荡，室温静置、离心，取上清液置于新的离心管中，重复操作1次；加入无水乙醇，低温条件下静置，离心、弃去上清液；加入70％乙醇溶液洗涤，离心、弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液。

5.根据权利要求3所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述菌株的基因组DNA的提取和纯化包括如下步骤：

取适量分离纯化后的菌体置于离心管中，加入溶菌酶溶液，混匀、水浴加热；加入十二烷基硫酸钠溶液，水浴加热；加入氯化钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液，水浴加热；将菌体裂解液转移至适宜的载体上，通过离心的方式去除菌体及裂解液，将核酸截留在适宜的载体上，加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，无水乙醇溶液等洗涤，离心、弃去洗涤液；室温风干至乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液溶解核酸，离心将其从适宜的载体上洗脱下来，作为核酸提取溶液。

6.根据权利要求1所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR扩增产物的提取和纯化方法包括如下步骤：

步骤1)取适量的扩增产物与上样缓冲液混合在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳；

步骤2)将步骤1)中结束电泳的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，加入适宜的缓冲液，水浴完全溶解；加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置、离心、弃上清液；加入75％乙醇溶液洗涤，离心、弃上清液、将乙醇挥发完全；加入适宜的缓冲液，混匀后作为核酸扩增产物的纯化溶液。

7.根据权利要求6所述的一种基于DNA特征序列的细菌核酸测序鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)可替换为如下步骤：

将步骤1)中结束电泳的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，加入醋酸钠，混匀；加入无水乙醇，混匀、离心、弃上清液；加入70％乙醇溶液，离心、弃上清液；待乙醇挥发完全后加入无菌水溶解DNA，作为核酸扩增产物的纯化溶液。