[发明专利]一种快速评估CAR-T细胞体外杀伤效率的方法

说明书

本发明公开了一种简单、快速评估CAR‑T细胞体外杀伤效率的方法，包括步骤：1)贴壁或悬浮培养肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞为含有CAR‑T细胞特异性识别抗原表位并稳定转染荧光素酶基因的肿瘤靶细胞；2)加入CAR‑T细胞，获得CAR‑T细胞和肿瘤细胞的混合培养体系；3)离心沉淀所述的混合培养体系中的细胞，培养基重悬细胞后，加入荧光素酶底物，检测细胞的荧光素酶活力值，记为K；4)设置对照如下：所述培养体系中不加入CAR‑T细胞，检测细胞的荧光素酶活力值为Kmin；培养基中加入细胞裂解液导致最大程度的细胞杀伤，检测细胞的荧光素酶活力值为Kmax；5)计算CAR‑T对肿瘤靶细胞的杀伤效率公式：杀伤效率％＝(Kmin‑K)/(Kmin‑Kmax)x100％。

技术领域

本发明涉及细胞免疫学技术领域，具体是通过检测荧光素酶标记的肿瘤靶细胞化学发光信号值，从而推算CAR-T细胞的杀伤效率。

背景技术

嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells,CAR-T)治疗技术通过将CAR基因在体外导入并稳定整合到患者来源T淋巴细胞基因组中，联合单链抗体的靶向作用和T淋巴细胞的效应功能，以非MHC限制性方式高特异性识别细胞表面靶抗原从而杀伤肿瘤靶细胞。CAR基因通常编码一个用于结合靶抗原的单链抗体可变区片段、跨膜结构域和细胞内信号结构域(如CD3ζ胞内结构域等)。因此，CAR-T治疗技术的基本原理是依赖抗体与肿瘤细胞膜表面的抗原表位靶点进行特异性结合，激活T细胞的细胞杀伤能力从而清除肿瘤靶细胞。针对不同靶点的CAR已经被开发，截至目前已有超过250项的CAR-T治疗恶性肿瘤临床试验在全球范围开展。靶向CD19的CAR-T技术治疗B细胞恶性肿瘤的基础研究与临床试验已取得里程碑式突破，治疗急性B淋巴母细胞白血病有效率在70％以上，治疗B细胞型非霍奇金淋巴瘤在50％以上。CAR-T治疗其他肿瘤也显示了良好的应用前景。

如何对CAR-T细胞的杀伤能力进行功能性检测？目前采用的一种方法是测定CAR-T细胞杀伤携带抗原表位的细胞系反映其杀伤效率。经典的测定效应细胞对靶细胞杀伤效率的方法包括酶释放法、核素法和化学发光法。酶释放法，如MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)释放法，稳定性较差，效应细胞的干扰较大导致灵敏度低；核素法(如铬-51标记)检测较准确，但其操作涉及放射性物质存在安全隐患；化学发光法常用荧光素酶-ATP法，需要裂解细胞释放荧光素酶等繁琐手续，检测费时费力。因此，开发一种简便、快速评估CAR-T细胞杀伤效率的方法是十分必要的。

发明内容

本发明人经过长期地创造性研究，通过大量的筛选和测试，惊奇地发现：荧光素酶标记的肿瘤靶细胞被杀伤后的存活细胞数量与细胞的荧光素酶活力值存在较好的线性关系。CAR-T细胞与荧光素酶基因稳定转染的肿瘤靶细胞共孵育数小时后，离心沉淀获得存活的肿瘤靶细胞可直接检测其荧光素酶活力，通过设置阳性和阴性对照，可准确计算出CAR-T细胞的杀伤效率。

在此基础上，本发明人提供了一种非治疗性和非诊断性的简便、快速检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率的技术方案，具体步骤包括：

(1)提供一种培养体系，在适合细胞培养的条件下，在所述培养体系中贴壁或悬浮培养肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞为含有CAR-T细胞特异性识别抗原表位并稳定转染荧光素酶基因的肿瘤靶细胞；

(2)在所述的含有肿瘤靶细胞的培养体系中加入CAR-T细胞，获得CAR-T细胞和肿瘤细胞的混合培养体系，共孵育特定的时间；

(3)离心沉淀所述的混合培养体系中的细胞，培养基重悬细胞后，加入荧光素酶底物，检测细胞的荧光素酶活力值，记为K；

(4)步骤(1)所述培养体系中不加入CAR-T细胞，培养时间与步骤(2)相同，通过步骤(3)方法检测所得荧光素酶活力值为Kmin；