[发明专利]一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法

说明书

本发明涉及一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，该方法将人神经母细胞瘤SK‑N‑SH细胞的RNA转录为cDNA，进一步用PCR方法获得人硒蛋白H基因，并将该基因连接到原核表达载体中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，表达产物用Glutathione‑Sepharose TM4B纯化。本发明的方法能够在保证不突变硒蛋白H的硒代半胱氨酸活性的前提下在大肠杆菌中表达硒蛋白H。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法。

背景技术

硒(Selenium)是人体重要的微量元素之一。近年来的研究表明硒与心血管疾病、肿瘤、神经系统等疾病有关，其参与甲状腺激素代谢、抗氧化系统使机体发挥正常免疫功能。硒蛋白(Selenoprotein)是近年来发现的一类通过特殊编码机制编码的蛋白质。硒以硒代半胱氨酸(Sec)的形式，利用三个终止密码子之一的UGA作为三联体密码子，通过一套高度特化的编码和合成机制编码到蛋白质中，因此Sec被认为是生物体内的第21种氨基酸。目前已知的其它硒蛋白在原核大肠杆菌中的表达纯化方式大都是将其中的硒代半胱氨酸(Sec)突变为容易编码的半胱氨酸，即将编码硒代半胱氨酸的UGA密码子变为UGC，将A碱基突变为C碱基，然后再进行后续的纯化步骤。然而，这种方法得到的蛋白会影响硒蛋白利用硒代半胱氨酸所发挥的功能活性，因此，需要真核生物硒蛋白H在原核生物中不突变其硒代半胱氨酸密码子的表达的新技术。

发明内容

为了解决上述技术问题的至少一个，本发明提供一种人源硒蛋白H的原核表达纯化方法，包括以下步骤：

(1)克隆人硒蛋白H的基因，用反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因；

(2)将上述扩增的硒蛋白基因与表达载体连接，构建人硒蛋白H基因表达载体；

(3)将上述表达载体转化到用于克隆的大肠杆菌，挑选阳性克隆提取质粒，转化至用于表达的大肠杆菌，得到重组后的大肠杆菌；

(4)诱导上述重组后的大肠杆菌，使其表达人硒蛋白H；

(5)纯化人硒蛋白H：

a.收集菌体溶于加入蛋白酶抑制剂的PBS中超声破碎，取细菌裂解上清；

b.利用Glutathione-Sepharose TM4B进行纯化。

在本发明的实施方案中，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的基因的引物如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明的实施方案中，所述反转录PCR法扩增硒蛋白H的PCR程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，共35个循环；终延伸72℃5min。

在本发明的实施方案中，将所述硒蛋白基因与表达载体连接的方法为：表达载体为任一表达载体，用相同的限制性内切酶对PCR产物和表达载体进行酶切，纯化酶切后的PCR产物和表达载体，用T4连接酶将纯化的PCR产物与表达载体连接。

在本发明的实施方案中，所述表达载体为pGEX-6p-1，所述限制性内切酶为Xho I和EcoR I。

在本发明的实施方案中，所述用于克隆的大肠杆菌为DH5α，所述用于表达的大肠杆菌为BL21。

在本发明的实施方案中，所述诱导重组后的大肠杆菌表达人硒蛋白H的方法为：将重组后的大肠杆菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养12h，之后按1：100倍扩大培养，于37℃继续振荡培养4h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达6hr。