[发明专利]一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于酶工程以及蛋白质工程技术领域。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加41h，是野生型的2倍，即本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的稳定性较野生型提高了2倍。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，属于酶工程以及蛋白质工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，因为其独特的高保湿性，热酸稳定性和安全性，被广泛应用于食品，农业，医药，化妆品。从20世纪80年代开始，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。我国卫生部于2005年正式批准海藻糖为新资源食品。

目前，生产海藻糖的方法主要有三种，分别是酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法。其中，MTSase和MTHase双酶法采用液化后的淀粉作为底物，两个酶协同反应，生产海藻糖，该方法生产海藻糖的转化率较高，副产物较少，并用廉价的淀粉作为底物，降低了成本，因而得到了广泛的应用。

在应用MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的过程中，淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)是双酶法生产海藻糖的关键。

麦芽寡糖基海藻糖合成酶有两种类型，高温酶和中温酶，其中，高温酶在宿主中表达差，比活相对中温酶低，但中温酶因为稳定性较差，转化温度不能过高，导致反应中容易染菌，同时，还要在后续补加酶，成本较高，因而，对于中温酶的热稳定改造显得尤为重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第415位氨基酸由甘氨酸突变为脯氨酸得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacter ramosus)。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明提供了上述一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备方法，包含如下步骤：

步骤1：根据突变位点设计突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变，构建含编码突变体的基因的质粒载体；

步骤2：将突变体质粒转化进宿主细胞；