[发明专利]提高L-精氨酸菌株生产能力的方法

权利要求书

1.一种提高L-精氨酸菌株生产能力的方法，包括以下步骤：

A.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；

B.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；

C.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))的基因组中多聚磷酸盐激酶基因(NCgl2620)起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变，由SEQ IDNO:13突变为SEQ ID NO:14，获得L-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V),NCgl2620mut6)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)通过下述方法制备：

A1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQ ID NO:1的引物argR-aL-F和序列为SEQ ID NO:2的引物argR-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aL片段；

A2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQ ID NO:3的引物argR-aR-F和序列为SEQ ID NO:4的引物argR-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aR片段；

A3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；

A4.Gibson连接上述argR-aL片段、argR-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；

A5.使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argR；

A6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；

A7.将质粒pK18mobsacB-argR转化入ATCC13032感受态细胞；

A8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(ΔargR)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因突变菌株通过下述方法制备：

B1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQ ID NO:5的引物argB-aL-F和序列为SEQ ID NO:6的引物argB-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aL片段；

B2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQ ID NO:7的引物argB-aR-F和序列为SEQ ID NO:8的引物argB-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aR片段；

B3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；

B4.Gibson连接上述argB-aL片段、argB-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；

B5.使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argBmut；

B6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；

B7.将质粒pK18mobsacB-argBmut转化入ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；

B8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))。