[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒低含量样品的病毒分离方法

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)低含量样品的病毒分离方法，还公开了用于猪流行性腹泻病毒富集和分离的免疫纳米磁珠，该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe₂O₃核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面。传统方法从多重感染和低PEDV含量样品中分离病毒，需要病毒纯化和长时间盲传，分离效率低，限制了PEDV的研究工作。本发明利用纳米磁珠和PEDV特异性单域抗体制备了免疫纳米磁珠，能够有效捕获和富集粪便、组织等多种样品中的PEDV。样品经处理后利用免疫纳米磁珠进行病毒捕获和富集，将结合病毒的免疫纳米磁珠直接接种到Vero细胞，即可实现对病毒分离。本发明制备的免疫纳米磁珠和PEDV分离方法，适用于临床复杂和低病毒含量样品中PEDV的快速、有效分离。

技术领域

本发明涉及一种用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离的免疫纳米磁珠，还涉及PEDV低含量临床样品的病毒高效分离方法。本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(poreine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)成员，是引起猪流行性腹泻(PED)的病原。PED是以感染猪的腹泻、呕吐和脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病，各种年龄的猪都能感染发病，尤其对哺乳仔猪具有较高致死率。猪流行性腹泻发病区域遍及全球，给养猪业带来巨大危害。对临床上患PED猪样品中病毒的快速分离鉴定，是研究PEDV流行病学、分子生物学以及高效疫苗研制的必要环节。然而，目前临床病原感染复杂多样，已经罕见单一病原感染的临床病例，这种情况使用常规方法对单一病原分离十分困难。同时对于一些低病原含量样本，使用常规方法分离也很难获得成功。因此，建立对临床多重感染和低病原含量样品中的目标病原有效分离的方法，对病原学、流行病学和疫苗等研究具有重要意义。

免疫磁珠在生命科学领域应用日渐普遍，尤其在病原检测和分离等方面。免疫磁珠分离技术是以抗体包被的磁珠为载体，利用抗原、抗体的特异性结合形成抗原-抗体-磁珠复合物，该复合物在磁场作用下可定向运动，从而实现抗原的特异性地分离。该方法结合了分散固相萃取的高效性、免疫亲合作用的特异性及磁回收的简便性，可有效简化前处理流程，缩短前处理时间，提高富集和分离效率。随着纳米磁珠制备和表面包被技术的不断成熟完善，各种抗体以及特异性亲和因子等都可用于磁珠包被，从而获得免疫磁珠，这些免疫磁珠的特异性则完全取决于包被的抗体或亲和因子。目前，常用的主要抗体包括单克隆抗体(IgG)、单链抗体、单域抗体(sdAb)等。单域抗体是骆驼科和软骨鲨鱼等血清天然存在的仅有重链的IgG抗体，该类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区的单一结构域组成，又称为重链抗体(VHH)或纳米抗体(Nanobody，Nb)。sdAb同普通IgG抗体分子一样保持了良好的、特异的抗原结合能力。同时，sdAb还具有易于在大肠杆菌表达系统中可溶性表达、耐高温、耐极度pH值等独特性质。这些特性使sdAb成为免疫磁珠制备的理想候选抗体。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种能够结合并高效富集猪流行性腹泻病毒(poreineepidemic diarrhea virus，PEDV)的免疫纳米磁珠；本发明的另一目的是提供一种PEDV低含量样品病毒有效分离的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种能够捕获并富集猪流行性腹泻病毒(poreine epidemic diarrheavirus，PEDV)的免疫纳米磁珠，该免疫纳米磁珠具有磁性的Fe₂O₃核心和偶联有PEDV膜蛋白特异性单域抗体的表面，该PEDV膜蛋白特异性单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，本发明还提出了一种制备所述的免疫纳米磁珠的方法，包括以下步骤：

(1)纳米磁珠的活化