[发明专利]一种颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒，包括引物GCD124‑PF1、引物GCD124‑PR1、内参引物M‑26F、内参引物M‑26R、探针GCD124‑W1、探针GCD124‑M1、内参探针M‑01D，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中本发明的试剂盒，本发明的试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对GCD II型的野生型和突变型进行检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程不超过2小时。

技术领域

本发明涉及一种颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒。

背景技术

颗粒状角膜营养不良(Granular corneal dystrophy,GCD)是一组以进行性角膜浑浊，最终导致严重的视力损害的少见的遗传性、双眼对称性、具有组织病理学特征的原发性疾病，中国人群以GCD-II型最为常见。Avellino角膜营养不良(Avellino CornealDystrophy,ACD)为角膜营养不良的一种，即通常所称的颗粒性角膜营养不良Ⅱ型(GCD-Ⅱ型)，其多于青少年期发病，双眼角膜中央区出现进行性沉积性颗粒状、杆状或雪花状浑浊，最终导致严重视力损害，早期诊断发现并治疗，防止或延缓视力损害。

目前对引起GCD-II疾病的基因研究最多的是转化生长因子β诱导蛋白基因(TGFβI)，并发现Avellino角膜营养不良疾病与TGFβI基因5q31区域上第4外显子突变有关，突变类型为p.R124H(CGC>CAC)。临床数据研究发现，TGFβI基因的p.R124H位点纯合突变造成的角膜营养不良相比于相应的杂合子点突变造成的角膜营养不良，其发病时间更早、症状更加严重，而且行角膜成形术后复发时角膜浑浊的出现速度可能更快，程度更加严重，表明ACD疾病的发病可能存在突变剂量累积效应。

携带有Avellino角膜不良症突变基因的患者，其角膜在受外伤或者受到紫外线、激光等的刺激后，会出现非正常蛋白质类物质沉积在角膜上，导致患者角膜混浊、视力严重下降，甚至失明。因此，携带有Avellino角膜不良遗传突变基因的患者，是绝对禁止进行准分子(包括LASIK、LASEK或PRK等)、半飞秒、飞秒等激光屈光手术。因此，有针对地进行颗粒性角膜营养不良(GCD)II型核酸的检测对激光屈光手术具有重要意义。

目前，颗粒性角膜营养不良(GCD)II型核酸检测的方法不多，方法如PCR法、DNA芯片法等。其中，PCR方法较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。由于单重PCR通量不高的局限性，一般在进行PCR反应后还需要做进一步实验才能鉴别GCD II型的野生型和突变型。DNA芯片法就是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息，但是，DNA芯片法步骤繁琐，包括样品中扩增DNA的步骤、使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤、清洗杂交的DNA芯片的步骤等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中颗粒性角膜营养不良(GCD)II型核酸检测方法较为繁琐的缺陷，提供一种高通量的颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种颗粒性角膜营养不良II型核酸检测试剂盒，包括引物GCD124-PF1、引物GCD124-PR1、探针GCD124-W1、探针GCD124-M1、内参引物M-26F、内参引物M-26R、内参探针M-01D；扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控，其中

引物GCD124-PF1的序列5'-3'具体为：AGAGGCCATCCCTCCTTCT；

引物GCD124-PR1的序列5'-3'具体为：GTTGCTAGGGGCGAAGATG；

探针GCD124-W1的序列5'-3'具体为：VIC-CTCCGTGCGGTC-MGB；