[发明专利]一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，包括引物AF‑F1、引物AF‑R1、引物BB‑F1、引物BB‑R1、探针AF‑P1、探针BB‑P1，扩增预混液、探针引物预混液、和阴、阳性质控。本发明的试剂盒，可采用多个不同的荧光对多个不同的探针进行标记，能够同时对HPV6和HPV11型进行检测；能够用于宫颈脱落细胞的HPV检测；经过核酸提取和纯化后的检测过程不超过2小时。

技术领域

本发明涉及一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，HPV的宿主为人类。HPV是一组病毒的总称，组成一个科，其病毒形态类似，DNA限制性内切酶图谱各异，核壳体蛋白质的抗原性不同，通过对人乳头瘤病毒克隆基因的DNA杂交试验及酶谱分析，至今已鉴定出100多种类型人乳头瘤病毒，每一型别都与体内特定感染部位和病变有关。所有HPV病毒的基因组结构相似，迄今已发现多种HPV类型，随着研究的深入，将会鉴定出更多HPV新的类型。人乳头瘤病毒(大约35种型别)可通过多种感染途径感染妇女生殖道，从而导致尖锐湿疣，约20种与肿瘤相关。至少有10个类型与尖锐湿疣有关(如6，11，16，18及33型，最常见6、11型)，而第11，16，18型，则是国外目前研究宫颈癌、外阴癌甚至阴茎癌的最热门的病毒因子，其长期感染与女性宫颈癌的发生有关。依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV，低危险型别HPV包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CIN I)，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CIN II/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型。从高危亚型人乳头瘤病毒的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，有针对地进行HR-HPV的检测对宫颈癌的早期诊断具有重要意义。

目前，HPV分型方法有很多，常见的有细胞生物学检测方法和分子生物学技术方法，如杂交捕获实验(HC)、原位杂交技术(ISH)和PCR方法等。其中，PCR方法较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。由于单重PCR通量不高的局限性，一般在进行PCR反应后还需要做进一步实验才能鉴别HPV不同的亚型；而且，如样本中存在不同的的型HPV的混合感染，不同的HPV型有不同的扩增反应效率，导致某些型相对于其它型有不均衡的扩增，不均衡的扩增使反应平衡趋向于样品中的高拷贝型，消耗了PCR反应的组分，使拷贝数少的型不易被检测出。因此，本试剂盒主要在荧光定量PCR的平台上结合了一种多重荧光PCR技术，特异性的FAM标记的TaqMan探针对待检测样本进行HPV 6和11亚型的检测。PCR多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。其中，最常见的类型是两重反应。与单重PCR技术相比，多重PCR技术具有更高的通量、更低的样本用量和试剂用量以及检测更加快捷等明显的优点。

另外，荧光PCR技术的荧光探针现已发展成多种类型，如TaqMan MGB探针、Beacon探针等。Taq-Man探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。其中，TaqMan MGB探针的原理一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子MGB修饰基团，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记，可大大降低本底信号的强度，同时MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计的更短，既降低了合成成本，大大增加了探针的稳定性，也使得探针设计的成功率大为提高。该方法具有如下优点：(1)容易设计；(2)探针短；(3)提高配对与非配对模板间的Tm值差异；(4)高特异性和高准确性；(5)稳定性好；(6)结果重复性好等。但是目前荧光PCR技术在人类乳头瘤病毒的检测上还不够成熟，不能够实现高通量的测定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种高通量的一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒。