[发明专利]一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用在审
| 申请号： | 201810573507.4 | 申请日： | 2018-06-06 |
| 公开（公告）号： | CN108707597A | 公开（公告）日： | 2018-10-26 |
| 发明（设计）人： | 朱龙宝;丰国强;葛飞;陶玉贵;宋平 | 申请（专利权）人： | 安徽工程大学 |
| 主分类号： | C12N11/14 | 分类号： | C12N11/14;C12N11/04;C12P13/22 |
| 代理公司： | 深圳市百瑞专利商标事务所(普通合伙) 44240 | 代理人： | 叶绿林;杨大庆 |
| 地址： | 241000 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 苯丙氨酸 变位酶 固化 重组酶 应用 固定化酶催化剂 硫酸铵 高效表达 多巴胺 高纯度 重组菌 自组装 大肠 提纯 包埋 催化 构建 制备 克隆 合成 基因 制造 生产 | ||
1.一种固化的苯丙氨酸变位酶，包括苯丙氨酸变位酶，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶包覆在精蛋白内，所述精蛋白的表面设置有硅酸钠层，所述硅酸钠层的外围包覆有多巴胺。
2.一种苯丙氨酸变位酶的固化方法，包括以下步骤：
1)将苯丙氨酸变位酶与碳酸钙溶于聚苯乙烯磺酸钠溶液中搅拌反应组装成CaCO3(PSS)PAM微粒；
2)将CaCO3(PSS)PAM微粒置于Tris-Hcl缓冲液中并加入精蛋白进行震荡处理得精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒；
3)将精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒加入硅酸钠溶液和Tris-Hcl缓冲液中反应30min得精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
4)将精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和多巴胺一起加入Tris-Hcl缓冲液中反应12小时后得多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
5)将多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和乙二胺四乙酸加入Tris-Hcl缓冲液中震荡处理得多巴胺-精蛋白-氧化硅-PSS-PAM的固定化酶微球，实现苯丙氨酸变位酶的固化。
3.如权利要求2所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶是将苯丙氨酸变位酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。
4.如权利要求3所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：将SEQ ID NO.1所示的基因与大肠杆菌表达载体pET28a连接，将连接后的产物转入E.coli BL21中进行表达，得到苯丙氨酸变位酶。
5.如权利要求4所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：还包括对酶进行纯化，具体步骤如下：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清液，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为40％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8，静置半小时后离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为60％，室温静置4～6小时后，离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在50mM Tris-Hcl缓冲液中透析12小时得纯化后的苯丙氨酸变位酶，中间每隔4小时换一次Tris-Hcl缓冲液；所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8。
6.一种应用固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸的方法，其特征在于：将α-苯丙氨酸、氨水和固化的苯丙氨酸变位酶加入Tris-Hcl缓冲液中混合反应得β-苯丙氨酸。
7.如权利要求6所述应用固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述Tris-Hcl缓冲液的pH值为8.5，反应温度为30℃。
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