[发明专利]基于CRISPR的基因组修饰和调控

权利要求书

1.一种工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其包含：

指导RNA，其包含：

(i)与真核生物染色体序列中的靶位点互补的第一区域，所述第一区域可与靶位点碱基配对，所述第一区域包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸，

(ii)形成茎和环结构的第二区域，和

(iii)基本单链的第三区域，

其中(i)、(ii)和(iii)以5'至3'方向排列，并且指导RNA包含两个分开的分子，

其中在指导RNA和II型CRISPR/Cas9蛋白之间形成蛋白-RNA复合物，其进一步包含核定位信号，并且通过指导RNA、II型CRISPR/Cas9蛋白和靶位点之间的相互作用将蛋白-RNA复合物指导至靶位点。

2.权利要求1的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二区域的长度为约16个至约60个核苷酸。

3.权利要求1或2的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第三区域的长度为约5个至约60个核苷酸。

4.权利要求1至3中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一分子包含指导RNA的第一区域和指导RNA的第二区域的茎的一半。

5.权利要求1至4中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二分子包含指导RNA的第二区域的茎的另一半和指导RNA的第三区域。

6.权利要求1至5中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白仅包含一个功能性核酸酶结构域。

7.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性RuvC样结构域。

8.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性HNH样结构域。

9.权利要求1至8中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自链球菌物种。

10.权利要求9的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自酿脓链球菌。

11.权利要求1至10中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白由针对真核表达优化的DNA编码。

12.权利要求11的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中DNA可操作连接至启动子控制序列用于真核表达。

13.权利要求11或12的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中编码工程化RNA指导的核酸内切酶的DNA包含在载体中。

14.权利要求1至13中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一分子是化学合成的，并且指导RNA的第二分子是通过体外转录合成的。

15.权利要求1至13中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一和第二分子由可操作连接至启动子控制序列用于真核表达的DNA编码。

16.权利要求15的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中编码指导RNA的DNA包含在载体中。

17.权利要求1至16中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中靶位点位于原间隔毗连基序(PAM)的上游。