[发明专利]用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用

说明书

本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，公开了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用，本发明成功筛选并合成1对荧光标记微卫星引物，该引物可以用于建立中华鲟和达氏鲟种间鉴定技术。将引物用于PCR扩增后，测定等位基因，进行中华鲟和达氏鲟的种间鉴定分析。本发明所述鉴别方法操作简单、快捷、费用低廉，具有高效、经济、简便易行的特点，可以在中华鲟和达氏鲟种间鉴定、种质鉴定和遗传管理中推广应用，并可对人工增殖放流效果进行评估。

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物及应用。

技术背景

中华鲟(Acipensersinensis)和达氏鲟(A.dabryanus)均为我国一级重点保护水生野生动物，隶属于鲟形目鱼类，鲟科，鲟属，是分布于长江流域的大型鱼类。两种鱼类的生态位存在一定的重叠。由于人类活动的干扰，如梯级水电站的修建、过渡捕捞、栖息地破坏等，已经造成两种鱼类处于濒临灭绝的危险。目前，针对这两种鱼类已经采取了一系列的保护措施，如建立自然保护区、实施迁地保护、人工繁育、增殖放流等。在人工繁育、增殖放流、自然种群监测等过程中，迫切需要对两种鱼类进行有效的鉴别。

地球上显存的26种鲟鱼中，中华鲟和达氏鲟亲缘关系最接近。进化上，学者认为达氏鲟是中华鲟的陆封种，二者遗传物质DNA存在高度的相似性。先前的研究发现，线粒体DNA的某些区域，如d-loop区域，COI基因，可对两种鲟鱼进行鉴定。然而，线粒体是母性遗传，并不能反应雄性亲本的遗传信息。最近，Li等(2015)发现3个核基因序列可对中华鲟和达氏鲟进行鉴定。然而，对该结果进行检验，存在不可靠性。专利申请人在前期的研究中发现了10个微卫星(simple sequence repeats，SSRs)位点组合，既可以对中华鲟进行亲子鉴定，也可以对中华鲟和达氏鲟进行种间鉴别，然而，该组合在实际操作过程中存在引物多、操作繁琐、容易误检的缺陷。因此，截止到目前，没有更为简便、有效的方法对两种鲟鱼进行快速鉴别。

发明内容

本发明的目的在于提供了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物，该引物可以用于中华鲟和达氏鲟的种间的快速鉴定。

本发明的另一个目的在于提供了用于中华鲟与达氏鲟种间鉴定的微卫星引物的应用。包括用于该引物制备成用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的试剂盒，或利用该引物对中华鲟和达氏鲟进行种间鉴定，或利用该引物进行中华鲟和达氏鲟的种质鉴定和家系管理。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR引物，具体如下：

P3-141F:TGCTGGTTAGAGCTTGGAGC；

P3-141R:AGGCATTTGACCCATTTGTT。

以上所述引物的正向引物，可用FAM荧光染料或本领域常用的荧光染料进行标记。

用于中华鲟和达氏鲟种间鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括制备中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒，或利用该引物进行中华鲟和达氏鲟种间鉴定，或利用该引物进行中华鲟或达氏鲟的种质鉴定和家系管理。

本发明提供的SSR引物的应用方法包括：

提取待鉴定的中华鲟和达氏鲟样品DNA，使用P3-141F和P3-141R SSR引物进行扩增。扩增结果显示，达氏鲟为单态，只有一个等位基因，大小为157bp；中华鲟为多态，≥2个等位基因，等位基因的大小有157bp、160bp、163bp、166bp。

本发明提供的中华鲟和达氏鲟种间鉴定试剂盒，其试剂盒包含：1对SSR荧光标记引物、2×Taq PCR Master Mix和超纯水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：