[发明专利]一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用

说明书

本发明提出了一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用，以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞，采用紫杉醇模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株，测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5‑FU等食管癌常用化疗药物的耐药指数，选出敏感药物5‑FU及顺铂进一步联合诱导建立获得性人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC，测定该细胞株的干细胞标志表达明显增高及转移迁移特性增强。本发明采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法，可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。

技术领域

本发明涉及耐药细胞株领域，特别是指一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用。

背景技术

食管癌是最常见的致命性恶性肿瘤之一，在我国的发病及死亡例数占世界一半以上。食管癌早期诊断困难，发现时常进展到中晚期。手术、化疗、放疗是治疗癌症的标准流程。手术后进行化疗可以有效地杀伤残余的肿瘤细胞，但是肿瘤细胞会对化疗药物产生多药耐药性，耐药细胞具有更强的转移性，肿瘤的远处转移是肿瘤治疗失败，造成肿瘤病人死亡的主要原因。因此克服、防止或逆转肿瘤细胞的多药耐药性对于提高化疗效果十分重要。而建立肿瘤多药耐药细胞株对于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选可性的耐药逆转剂及寻找耐药肿瘤细胞的治疗靶点具有重要的应用价值。

食管癌的化疗是治疗过程中的一个重要手段，食管癌的化疗药物治疗目前还停留在细胞毒药物化疗上，包括紫杉醇(PTX)、顺铂(CDDP)、5-氟尿嘧啶等。紫杉醇是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。顺铂属细胞周期非特异性药物，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，对RNA的合成也有一定抑制作用。阿霉素属周期非特异性药物，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。

目前实验室所获得耐药细胞多为一种化疗药物筛选而来，而临床上肿瘤患者化疗时常常为多种化疗药物联合应用，或者一种化疗方案产生耐药时更换化疗方案再进行新一轮的化疗，肿瘤细胞经历了多种化疗药物，长时间的作用后，细胞生物学特征与经历一种化疗药物作用的肿瘤细胞相比发生了很大的改变，实验室尚未见和临床化疗经过相似的耐药细胞系。

发明内容

本发明提出人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用，解决体外筛选抗肿瘤药尚未有耐紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的细胞株的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种人食管癌多药耐药细胞株的构建方法如下：

(1).将人食管癌细胞EC9706加入含10％血清的1640培养液进行培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代；

(2).当细胞生长至密度达到80％时，更换新鲜的培养液，并在细胞培养液中加入紫杉醇，使得紫杉醇的作用浓度为2.5μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，弃去含紫杉醇的细胞培养液，换用新鲜的培养基；

(3).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复培养3次，得到在紫杉醇作用浓度为2.5μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；

(4).将步骤(2)中紫杉醇的作用浓度逐步增至5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，再将步骤(3)得到的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；