[发明专利]一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用，该试剂盒由反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品和阴性对照品冻干管组成。荧光定量PCR反应液冻干管由Taq酶、反转录酶、检测用引物、探针和dNTPs混合冻干而成。本发明试剂盒检测时间短(反应时间仅42分钟)、特异性强、灵敏度高、便于储存(4℃保存)，配合恒温隔绝式PCR仪使用，非常适合对基因C型鸭甲肝病毒的现场快速检测，可以在基层广泛推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于恒温隔绝式荧光 PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用。

背景技术

基因C型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type C,DHAV-C) 以引起鸭的肝炎及多器官出血为特征。近年来在亚洲地区广泛流行并导致经济损失(任丽倩,李晶,毕玉海,等.鸭甲型病毒性肝炎的研究进展[J].生物T程学报,2012,28(7):789～799)。鸭病毒性肝炎1945年在美国首次被发现，DHAV最终被归为小RNA病毒科、禽肝炎病毒属、鸭甲型肝炎病毒、血清l型鸭甲型肝炎病毒(Levine p，Hofstad M.Duck disease investigation[J].Annual Report of the New York State Veteri nary College,Ithaca,1945,55～56)，之后被鉴定出三种基因型即DHAV -A、DHAV-B、DHAV-C，其中A型和C型在中国及韩国鸭场的发生的频率较高。近年我国流行病学调查结果显示，在以往防控政策的影响下， DHAV-A型病毒的流行趋势得到有效控制，而DHAV-C在我国诸多养殖场被检出(Lin SL,Cong RC,Zhang RH,et a1.Circulation and in v ivo distribution of duck hepatitis Avirus types 1and 3in infected d ucklings[J].Archives of virology,2015,l-12)，表明DHAV-C已日渐成为我国鸭病毒性肝炎的主要病原，因此对该病原流行病学调查和有效监测具有重要意义.

能引起鸭肝炎的病原较多，包括基因A型鸭甲肝病毒，新城疫病毒，鹅细小病毒，番鸭细小病毒，禽流感病毒，禽腺病毒，鸭星状病毒1 型，鸭星状病毒2型，鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌O46、沙门氏菌、鸭疫里默氏菌等，且临床上感染引起的症状多不典型，仅凭临床症状较难区分，故早期的鉴别诊断尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据，是最可靠的诊断手段，PCR、荧光定量PCR是最为常用的病原学检测手段，尤其荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已经成为动物疫病诊断的主流手段。但是普通的荧光定量PCR方法由于需要大型设备、操作复杂、反应时间长等因素制约了其在现场快速检测方面的应用。

因此针对基因C型鸭甲肝病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于恒温隔绝式荧光 PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用，本发明是基于恒温隔绝式荧光PCR的一种简单、快速、灵敏度高和特异性强的检测方法，可以为基因C型鸭甲肝病毒的现场检测提供科学依据，对保障水禽养殖业健康发展具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR 平台的基因C型鸭甲肝病毒检测的引物和探针，所述引物和探针包括：基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针，其中，所述基因C型鸭甲肝病毒上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；所述基因C型鸭甲肝病毒下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示；所述基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如SE Q ID NO.3所示；基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有 FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。

本发明还公开了一种上述的引物和探针在制备基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒方面的应用。