[发明专利]一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法

权利要求书

1.一种肝癌基因检测panel的制备方法，包括如下步骤：

1）、筛选肝癌相关基因，建立本地数据库：分别收集同一肝癌患者的配对样本，所述配对样本为实体瘤组织样本与血细胞或者癌旁组织样本配对，采用NGS测序技术分别对配对样本进行基因检测，通过分析比较，选择突变频率≥5%的基因区域，通过perl脚本流程对各种数据进行录入，标准化过滤处理，最后输出备选gene列表；

2）、从已公开文献资源中选择已公开肝癌相关基因，所述已公开肝癌相关基因包括：公共数据库中的高频突变基因，应用标准、治疗指南、药物标签及通用数据库中的肝癌治疗相关基因，已公开文献中报道的与肝癌分子分型、治疗、预后、诱发相关的基因；

3）、将上述肝癌相关基因合并，去冗余，并通过NCBI office name或HGNC approvedOfficial Symbol系统确定标准基因名，获得肝癌检测芯片基因集；

4）、选择用于探针设计的基因目标区域：对于步骤1）和步骤2）中收集的基因，如果明确具体变异位置，则根据已明确的基因位点覆盖区域来选择目标区域；对于位置较集中或密集的基因区域，则选择外显子作为目标区域；对于与肝癌高度相关的重要基因，则选择全部可变剪切类型的区域作为目标区域；

5）、将步骤4）中选择的基因目标区域向两端延伸，长度为50bp，合并全部选择区域后去冗余，最终形成探针设计的bed文件，该bed文件包含目标区域的染色体编号、目标区域的起始位置、目标区域的终止位置、自定义信息；

6）、panel探针设计：根据步骤5）所形成的bed文件中各目标区域的位置信息，从人类基因组中可设计探针数据集中寻找可以设计探针的设计区域，根据设计区域和探针设计参数生成探针，其中所述可设计探针数据集是将基因组的Alu重复区域、串联重复区域、假基因中重复度高或者组装质量低的区域剔除之后形成的可以进行捕获探针设计的数据集；

7）、探针设计评估：将筛选出的与肝癌高度相关的重要位点及全部目标区域与步骤6）中选择的探针设计区域进行比对，计算探针覆盖所述重要位点的覆盖度和全部目标区域的覆盖度，计算公式为：覆盖度=比对上的读长数/目标测序读长数，如果符合全部目标区域覆盖度≥90%、重要位点覆盖度≥99%的覆盖需求，则可进入下一步panel合成；如不合格，则需在目标区域附近选择合适探针；

8）、panel合成：在步骤7）中设计的探针两端添加固定的扩增序列，合成DNA单链，PCR扩增，转录成RNA探针，添加生物素标记，得到肝癌基因检测panel。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述公共数据库中的高频突变基因的收集是通过对公共数据库中检测肝癌患者的检测数据进行过滤，选择高频突变基因，筛选方法为下载TCGA、COSMIC数据库，对肝癌患者的基因突变频率进行计算，排序后过滤，选择前20个基因；以同样的方法，在ICGC数据库中选出肝癌样本的检测数据，包含LIRI-JP、LINV-JP、LIHC-US、LICA-FR、LIHM-FR五部分数据，计算基因的突变频率，排序后过滤，选择前20个基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述应用标准、治疗指南、药物标签及通用数据库中的肝癌治疗相关基因的收集是从数据库PGKB、NCCN、US. FDA drug、CFDA，应用标准，治疗指南，药物标签中收集肝癌治疗相关基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述已公开文献中报道的基因的收集是通过现有技术文本挖掘筛选出文献中的重要基因，文本挖掘的关键参数包含癌症类型、发病机制、癌症风险、预后、检测方法、分子检测类型、治疗方法，通过关键词建立词库，并选择关键词之间的“和/或”联系，通过脚本对NCBI Pubmed文献进行挖掘，最终从文本挖掘的选出文献中筛选出与肝癌分子分型、治疗、预后、诱发相关的重要基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8）中的所述RNA探针为单链RNA探针。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝癌基因检测panel固定在基因芯片的硅片或玻片上；或者采用液相反应池，RNA单链探针不固定在固相载体上。