[发明专利]一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法

说明书

本发明公开了一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。本发明提供了一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库。本发明具有以下优点：1、使用了barcode标签，并将其简化为4bp长的序列组合，提高利用率，提高检测灵敏度，合成简单，成本低，使用方便，极大的提高了adapter的连接效率和测序数据中duplex标记分子的比例。2、使用的识别duplex的生物信息分析方法，可以快速有效去除测序、捕获和PCR过程中引入的错误，降低检测的假阳性。

技术领域

本发明涉及一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。

背景技术

ctDNA(circulating tumor DNA)，即循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞释放的存在于血液、脑脊液等体液中DNA片段，是一种特征性的肿瘤生物标记物。ctDNA的变异检测，可用于肿瘤的早期诊断、肿瘤发生发展及疗效的动态监测、耐药检测、复发风险评估等。ctDNA在血浆等体液中的含量很低，通常小于总cfDNA的1％，变异检测难度极大。

目前用于ctDNA突变检测的技术主要有ARMS法(主要是Super-ARMS)、第二代测序(NGS)和数字PCR(dPCR，包括BEAMing技术)。Super-ARMS及数字PCR技术简便快速，特异性及灵敏度均较高，缺点是只能检测有限个数的已知突变，通量低。NGS通量高，检测基因数量不受限，可检测已知或未知突变。但是NGS技术复杂、耗时长且不易标准化，文库制备及测序的过程中都可能引入假阳性，影响结果判读。

NGS检测结果的假阳性主要有三个来源：1.文库制备过程中积累的PCR错误；2.测序过程中产生的测序错误；3.样品间污染，主要是Hiseq X、Novaseq等测序平台固有技术缺陷造成的index标定到错误样品上的问题，又称作“标签跳跃”(index hopping)。

Duplex技术在文库构建时利用特殊的接头序列，能够在目的片段的两侧引入随机的标签序列，从而标记来源于同一分子的正负链。通过正负链双重矫正，可以极大的减少PCR错误和测序错误带来的假阳性。该技术在ct DNA变异检测的应用中，存在两个主要的问题：1.接头序列纯度较低，连接过程中造成原始分子损失；2.测序结果中检测到的duplex比例很低(10％-15％左右)，大部分分子无法进行正负链矫正。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用duplex方法检测ctDNA低频突变的文库构建和测序数据的分析方法。

本发明提供了一种构建用于检测ctDNA低频突变的文库的方法，依次包括如下步骤：

(1)将ctDNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；

(2)将步骤(1)处理后的ctDNA与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；

所述接头混合物由n个接头组成；

每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；

上游引物甲中具有barcode标签甲；下游引物甲中具有barcode标签乙；

barcode标签甲和barcode标签乙反向互补；

barcode标签甲由A、T、C和G组成，排列顺序任意；

n个接头采用n个不同的barcode标签甲；

n为≥8的任意自然数。

所述上游引物甲的3’末端的第一个核苷酸为具有修饰的T；所述修饰的目的为防止核酸外切酶降解；下游引物甲的5’末端进行磷酸化修饰。