[发明专利]检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法

说明书

本发明提供检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法。本发明检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物包括针对rfbE基因的上游引物Seq ID No.1和下游引物Seq ID No.2。相对于现有技术，本发明的试剂盒及检测方法，可快速检测样品中是否存在大肠埃希氏菌O157核酸。操作简单，无需特殊昂贵的仪器，在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物和探针、试剂盒及RPA等温快速检测方法。

背景技术

大肠埃希氏菌O157是肠出血性大肠埃希氏菌主要的血清型，它可以导致病人出现腹泻、出血性肠炎及相关的病发症，严重的会危及病人生命。该病菌曾多次在国外和我国爆发、流行，给全球的经济带来了巨大的损失，目前它已成为了世卫组织关注的一个热点问题。因此，开发大肠埃希氏菌O157的快速检测方法对该菌的预防和检测非常重要。

目前大肠埃希氏菌O157的检测方法主要是分离培养法和PCR方法。分离培养法无需昂贵的设备，成本较低，但是该方法对人员要求较高并且检测周期较长，无法实现对样品的快速检测。基于分子生物学原理的PCR方法也被大量应用到了大肠埃希氏菌O157的检测之中，该检测方法由于需要配套较昂贵的设备因而也不利于在基层单位中的推广也不利于现场快速检测。因此为确保食品安全的快速发展，急需有关大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。

重组酶聚合酶等温扩增技术( recombinase polymerase amplification, RPA)是2006年由英国研究人员研发的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物形成复合体，酶促使引物定位到DNA双链模板的同源靶序列上，解链模板DNA，引物与模板单链结合并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，同时单链DNA结合蛋白与另外一条模板单链结合。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有基于大肠埃希氏菌O157 rfbE基因的引物和探针及检测方法被应用于大肠埃希氏菌O157的检测中。

目前多种大肠埃希氏菌O157的毒力基因和染色体上的基因被当作靶基因应用于大肠埃希氏菌O157的检测中，但是这些靶基因特异性并不理想。大肠埃希氏菌O157 rfbE基因是与O157脂多糖抗原编码相关的基因，有文献报导针对该基因建立的PCR法可以特异检测出大肠埃希氏菌O157，并且该方法对其他O血清型大肠埃希氏菌和肠道微生物的检测结果全都为阴性。因此基于大肠埃希氏菌O157 rfbE基因的RPA引物和探针及RPA检测方法在对大肠埃希氏菌O157的检测中将有着优良的特异性。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种方便快速的检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物、探针、试剂盒和方法。

一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，针对rfbE 基因包括

上游引物Seq ID No.1: 5’-AAAGGTAAATATGTGGGTTGATAACGACTA-3’和下游引物Seq IDNo.2：5’-AAAATCATCAGCTTGTTCATTCACCCGATA-3’。

一种检测大肠埃希氏菌O157的RPA引物，采用所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。