[发明专利]一种肺癌高通量测序文库及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种肺癌高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以肺癌相关片段为模板进行多重PCR扩增，得到肺癌初始文库；

(2)向装有所述步骤(1)肺癌初始文库的原管中加入0.3～0.7倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，取上清液至新管，弃磁珠；

(3)向所述步骤(2)含有上清液的新管中加入0.7～1.1倍PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；

(4)对所述步骤(3)磁珠进行清洗纯化，得到纯化的肺癌初始文库；

(5)对所述步骤(4)纯化的肺癌初始文库进行第二次PCR扩增，得到肺癌测序文库；

(6)向装有所述步骤(5)肺癌测序文库的原管中加入0.8～1.2倍第二次PCR反应体系体积的磁珠液，反应1～30min后，弃上清液，得到磁珠；

(7)对所述步骤(6)磁珠进行清洗纯化，得到纯化磁球；

(8)洗脱所述纯化磁珠表面的DNA，得到的洗脱液即为纯化的肺癌测序文库；

所述步骤(3)～(8)在同一个管中操作。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中多重PCR扩增包括两阶段：第一阶段为RNA扩增，所述RNA扩增用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～50所示；第二阶段为DNA扩增，所述DNA扩增用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.51～70所示。

3.根据权利要求2所述的肺癌高通量测序文库的构建方法，其特征在于，在所述步骤(1)中多重PCR扩增时采用30μl的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括以下含量的组分：10μl的反应缓冲液，8μl浓度独立为0.9～1.1μmol/L的RNA扩增用引物，1μl浓度为10ng/μl的模板和11μl的ddH₂O；所述扩增反应液包括200U/L聚合酶，100mmol/LpH 8.8的Tris-HCl，500mmol/L的KCl，15mmol/L的MgCl₂和质量浓度为0.8％的NP-40。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s，60℃，4min，18个循环；72℃，4min。

5.根据权利要求1～4任一项所述构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中的清洗用溶剂包括B&W和/或体积比68～72％的乙醇水溶液。

6.根据权利要求1～4任一项所述构建方法，其特征在于，所述步骤(5)第二次PCR扩增中包括上游街头引物和下游街头引物，所述上游街头引物的核苷酸序列如SEQ ID No.71所示；所述下游街头引物的核苷酸序列如SEQ ID No.72～167所示。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，在所述步骤(5)第二次PCR采用30μl的PCR反应体系，所述PCR反应体系包括10μl反应缓冲液，1μl浓度独立为10μmol/L的DNA扩增用上游街头引物，1μl浓度独立为10μmol/L的DNA扩增用下游街头引物和余量的水；所述反应缓冲液包括200U/L聚合酶，100mmol/L pH 8.8的Tris-HCl，500mmol/L的KCl，15mmol/L的MgCl₂和质量浓度为0.8％的NP-40。

8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中第二次PCR扩增的反应程序为：95℃，3min；95℃，15s，58℃，15s，72℃，30s，6～8个循环；72℃，5min。

9.权利要求1～8任意一项所述构建方法得到的肺癌高通量测序文库。

10.权利要求9所述肺癌高通量测序文库在体外定性检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的石蜡包埋组织切片中EGFR、BRAF、PIK3CA、KRAS、NRAS、ALK、ROS1基因的变异中的应用。