[发明专利]一种能够快速获得牙鲆稳转细胞系的载体

权利要求书

1.一种质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是带有Tol2转座子的DNA质粒载体，所述的质粒载体中还携带有牙鲆特异性的β‐actin启动子；

所述的牙鲆特异性的β‐actin启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体中包含有新霉素抗性筛选标记。

3.如权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体还包含有EGFP荧光标签。

4.如权利要求3所述的质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

5.权利要求1‐4任一项所述的质粒载体在将外源基因整合到牙鲆细胞中的应用。

6.一种将外源基因转染牙鲆细胞的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1‐4任一项所述的质粒载体将外源基因转染到牙鲆细胞内。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法使将利要求1‐4任一项所述的质粒载体与结合编码合成转座酶的质粒pCS‐TP进行共转染。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

步骤1：将生长状态良好的牙鲆细胞用胰酶消化后传代至12孔板，待其生长至90‐95％融合时，转染前一天换不含抗生素的DMEM‐F12培养基；

步骤2：用DMEM‐F12培养基同时稀释权利要求1‐4任一项所述的质粒载体和pCS‐TP质粒；

步骤3：用DMEM‐F12培养基稀释转染试剂LipGene 2000 plus Transfection Reagent，室温孵育5min；

步骤4：将步骤2稀释的质粒和步骤3稀释的转染试剂轻轻混匀，室温放置20min；

步骤5：将步骤4混合的试剂，每孔100ul分别加入12孔板，并做好标记；

步骤6：转染5h后更换培养基DMEM‐F12，同时加入10％FBS、1％非必需氨基酸和1％双抗；

步骤7：转染24h后加入800ng/mL的G418筛选，筛选时长2周，期间每3天换一次培养液；

步骤8：筛选2周后再稳定培养2‐3周，期间不加G418筛选；

步骤9：最终在倒置荧光显微镜中观察细胞的EGFP绿色荧光，确认是否所有的细胞都转入了外源基因。