[发明专利]一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法

说明书

本发明提供了一种特异的人牙根尖乳头干细胞亚群及其富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙根尖乳头干细胞的分离，及表达CD18干细胞的富集。本发明还提供了一种富集的牙根尖乳头干细胞亚群生物学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能力检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。

技术领域

本发明涉及一种通过细胞表面标记，优选CD18特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法。本发明也涉及将通过本发明富集的细胞用于再生医学的用途。

背景技术

患有根尖周炎或根尖脓肿的年轻恒牙，在经保守的根管治疗后，会出现牙根尖持续的发育和成形。在这个过程中，存在于牙根尖乳头中的干细胞可能起重要作用。

申请人在以前的研究中，通过酶消化法从牙根尖乳头中分离获得具有克隆形成和高增殖能力的细胞。这些细胞在体外具有多向分化能力，包括成骨、成软骨、成脂等。当将这些细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，移植于裸鼠皮下时，可形成牙本质样结构。

和牙髓干细胞相比，牙根尖乳头干细胞有更强的增殖能力和组织再生能力。这个可能是因为根尖乳头干细胞源自发育中的组织，所以代表了一群更幼稚的干细胞。

但这些细胞是高度异质性的，是否像骨髓干细胞一样存在严格的层级、谱系目前还不是很清楚。另外，因为缺乏特异的表面标记，不利于细胞的体外分离和鉴定，也影响对其临床功效的研究。

因此，通过特异的表面标记提取特定的细胞亚群，不仅对细化研究这些细胞的生物学特性、了解牙根尖乳头干细胞的全貌至关重要，而且对不同细胞亚群是否有不同的临床效果的研究也是非常关键的，有巨大的基础研究和临床意义。

所述的细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。

CD18，也称整合素β2亚家族，是细胞粘附分子中的一员，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用。由于CD18在白细胞上显著表达，过去的很多研究都集中于CD18在白细胞粘附、迁移和免疫反应中的作用。

但事实上，CD18也在骨髓基质干细胞上表达，且在骨发生过程中发挥关键作用。缺乏CD18的小鼠表现出骨质疏松症的某些特征，包括骨密度降低，小梁骨数目减少，小梁骨厚度减少，骨小梁空间增加等。而通过病毒转染，过表达CD18可促进骨的形成。

申请人最近的研究证实，牙根尖乳头干细胞也表达CD18，而且CD18可作为一个独特的细胞分选标记，用于富集一种人牙根尖乳头干细胞亚群。

发明内容

如上文所述，骨髓基质干细胞也表达CD18。考虑到牙根尖乳头干细胞分化为功能性成牙本质细胞（odontoblast）的路径，和骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的路径相似。比如，骨形成过程中有效的调控因子，如TGFβ、BMP-2、和BMP-4被认为启动了成牙本质细胞的发育。其它一些能够影响成骨细胞的生长因子，包括bFGF、PDGF、EGF、IGF-1、TNFα、和IL-1β，也调控成牙本质细胞前体细胞的增殖和分化。再如，成牙本质细胞和成骨细胞表达相似的矿化基质蛋白，如牙本质基质蛋白1、纤粘蛋白、I型胶原、碱性磷酸酶、骨结合素、骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨钙素等。我们创造性地发明了一种通过CD18特异性富集人牙根尖乳头干细胞亚群的方法，大大提高了体外牙根尖乳头干细胞分离和鉴定的效率。更为重要的是，通过该方法富集的牙根尖乳头干细胞亚群有更强的克隆形成能力，更优的成骨分化能力，具有优越的科研和临床应用前景。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供了一种特异的人牙根尖乳头干细胞亚群的富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙根尖乳头干细胞的分离，及表达CD18细胞的富集。