[发明专利]一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂。本发明根据DHBV基因保守区设计合成特异性LAMP引物，包括上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，检测试剂包括如下组分：10×Bst Buffer反应缓冲液、dNTPs、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、去离子水、显色试剂和上述引物。本发明提供的检测试剂在应用时具有特异性强、灵敏性高、操作简便、成本低廉等优点。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增检测 试剂。

背景技术

鸭乙型肝炎病毒(Duck hepatitis B virus,DHBV)与人类乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝 DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主规律等方面 均较为相似，DHBV病毒颗粒为球形，有囊膜，直径40-50nm，经卵垂直传播，所以雏鸭 感染率最高，感染后无临床症状，但有报道认为其感染可引起肝细胞变性和点灶状坏死， 汇管区炎性细胞浸润等肝炎样病理改变。DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复 制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。与人HBV一样，鸭血清中的 DHBV-DNA的滴度是病毒复制活动最直接、最可靠的标志。通过检测血清中肝炎病毒 DNA滴度，可以分析病毒在体内的复制活动情况，从而为研究病毒性肝炎的发病机理、 评价和预测抗病毒药物的疗效提供重要依据。

核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一，目前核酸扩增的方法有聚合酶链式反 应(PCR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、自主序列复制(SR)以及链置换技术(SDA)等，都能将微量标本进行快速扩增，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面各有缺点。本研究所涉及的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法是2000年由日本Notomi等人开发出来的一种体外核酸 扩增的新型技术，它能够在1h内，水浴锅环境等温条件下，把拷贝数很低的DNA片段 扩增到10⁹个拷贝。反应过程中，由于反应溶液中的Mg²⁺与dNTP析出的焦磷酸根离子结 合产生副产物焦磷酸镁白色沉淀，因此，仅用肉眼观察或使用浊度仪检测浊度就可以判读 结果，浊度仪还可以对起始模板定量，这是最常用、最简单的检测方法。

环介导等温扩增技术是当前应用最为广泛的一种核酸快速扩增的新型技术之一，与主 流的PCR技术有着根本不同的设计思路，其特点是分别使用对应于靶序列中6个基因区 段的2对特殊引物(外引物F3,B3；内引物FIP,BIP)，利用Bst DNA polymerase在延伸DNA同时的链置换活性，对目的片段进行链置换扩增，不需要双链DNA模板的预变性、 退火及繁琐的循环变温过程，整个反应在恒温条件(61～65℃左右)下几十分钟即可完成 核酸扩增，扩增效率一般高达到10⁹-10¹⁰个数量级，大量的核酸产物可使反应结果通过在 终产物中加入核酸染料的方法直接用肉眼观察。随着研究人员对LAMP技术认识的深入， LAMP技术还在快速地发展与优化，在疾病致病原基因诊断、食品安全分析和环境监测等 领域发挥着越来越重要的作用。由于LAMP检测技术在各项检测上的优越性，人们已经 将它广泛应用到病原体检测、动物胚胎性别的鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测等 各个领域，LAMP检测技术具有非常高的应用价值。LAMP检测技术操作简单、用时短、 准确率高，相当适合养殖场现场操作，这项技术的应用将大大降低畜牧业的发展成本，减 少其经济损失，从而提供相当高的经济效益。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在 基层推广应用，具有很强的临床意义。

发明内容

为克服普通检测效率低、难操作、成本高的缺陷，本发明的目的在于提供一种鸭乙型 肝炎病毒的环介导等温扩增检测试剂，应用该试剂进行检测时，检测时间短，特异性和敏 感性高，操作方便且成本低。

本发明的第一个目的是提供用于检测鸭乙型肝炎病毒的环介导等温扩增引物组，所述 引物组由以下引物组成：