[发明专利]金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立

权利要求书

1.金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，所述三组引物和探针分别具有以下碱基对：

以金黄色葡萄球菌nuc基因为对象：

上游引物(5’-3’)TTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC

下游引物(5’-3’)TTGCACTATATACTGTTGGATCTTCAG

探针(5’-3’)FAM-TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG-BHQ1；

以大肠杆菌0157：H7wzx基因为对象：

上游引物(5’-3’)TCATGCACGCAATGATACTCAA

下游引物(5’-3’)CGAACACTACTAATATGAAGGCCA

探针(5’-3’)CY5-AGACGCTCAGAACATCATTGAAAATAGTGGG-BHQ2；

以沙门氏菌invA基因为对象：

上游引物(5’-3’)CCTGATCGCACTGAATATCGTACT

下游引物(5’-3’)GTGGTAATTAACAGTACCGCAGGA

探针(5’-3’)Vic-ATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGAC-BHQ1。

2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：设计所述三组引物和探针；

步骤二：引物特异性检测；

步骤三：金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因的克隆及质粒提取鉴定；

步骤四：对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌分别进行探针单重特异性测定；

步骤五：探针法多重特异性检测；

步骤六：多重条件探索；

步骤七：标准曲线建立。

3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，步骤二中所述引物特异性检测时，

PCR体系如下：

PCR反应条件如下：

大肠杆菌0157：H7和沙门氏菌的PCR反应条件：

金黄色葡萄球菌的PCR反应条件：

4.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，步骤四中所述单重特异性测定时，

qPCR体系如下：

qPCR条件如下：50℃，2min；95℃，5min；(95℃，40s；60℃，40s；)×40个循环。

5.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，步骤五中所述探针法多重特异性检测时，将金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌放在同一个体系进行扩增，qPCR体系如下：

6.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，步骤六中所述多重条件探索时，Mix固定30μL，探针设3个浓度(0.4μL、0.3μL、0.2μL)，最终选定探针浓度为0.4μL；探针固定为0.4μL，mix设30μL、40μL、mix 35μL，最终选定mix浓度为30μL。

7.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法的建立中的应用，其特征在于，步骤七中建立的标准曲线为：

金黄色葡萄球菌：Y＝-4.929X+58.824 R²＝0.999 Eff％＝86.721

沙门氏菌：Y＝-4.74X+57.046 R²＝0.996 Eff％＝90.775

大肠杆菌O157H7：Y＝-4.277X+52.119 R²＝0.997 Eff％＝84.861。