[发明专利]一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该环介导等温扩增检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为检疫性疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于丁香疫霉的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对出入境水果样品中的丁香疫霉进行检测。本发明对丁香疫霉引起的疫病和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。

背景技术

丁香疫霉(Phytophthora ramorum)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。该菌寄主分布范围广，主要分布于美国、日本、加拿大、英国、法国、德国、意大利、澳大利亚等国，在我国未有发生报道。该病菌主要通过被侵染病菌的幼成年苗、泥土和果实远距离传播。病菌主要侵染柑橘类水果、李属类水果、火棘、丁香、欧洲板栗、橡树等14个科29个属的植物，引起寄根、茎、叶、果实多种病变，是一种危害性极大的重要的植物病原菌，于2007年被列入我国进境植物检疫性有害生物名单。2011年，天津市检验检疫局首次在美国脐橙上截获丁香疫霉。被病菌侵染的柑橘类果实会逐渐褐腐、枝干流胶、根颈部脚腐和根腐，植株活性降低，出现枯萎，叶片褪绿萎蔫，最后会导致植物整株的死亡，严重影响果实产量和品质，带来重大经济损失，严重威胁世界柑橘生产。我国水果产量位居世界第一，是生产水果的大国，种植面积近1000万hm²，平均每年的产量带来的收益超过2800亿元。水果种植已成为农业生产行业致富的重要途径，对我国的农村经济和社会经济的发展起到了非常重要的作用。该疫霉一旦传入我国并定殖将对我国的水果种植业造成毁灭性的打击香疫霉可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击。丁香疫霉寄主广泛，可以侵染上千种植物。据报道，丁香疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低樟树疫病引起的损失。

传统的丁香疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕丁香疫霉。传统方法在丁香疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测丁香疫霉，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。丁香疫霉的三重PCR同步分子检测方法，以热激蛋白HSP90序列为检测目标，用14种疫霉病菌的15个菌株对引物特异性进行验证，结果常规PCR和多重PCR的检测灵敏度分别为200pg和2ng，常规PCR检测低限为12pg，两者相差近10倍。PCR荧光检测和常规检测已经在进境的一些李属、柑橘属水果上进行了快速检测，同时还开展了其它寄主上丁香疫霉的测试，荧光检测和常规检测便于在口岸实验室应用和推广，特异性较好，灵敏度高。三重PCR同步分子检测方法可有效促进进境水果的快速通关，可以可靠地检测在口岸与田间的检疫性病原菌，但其缺陷在于引物多对，容易导致引物二聚体或错配，使其灵敏度下降。