[发明专利]一种冬生疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种冬生疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法，该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为冬生疫霉的检测提供了新的技术平台，可用于冬生疫霉的高灵敏度快速检测，同时能够对人工接种发病组织验证中，只有发病组织提取的DNA样本经过LAMP反应出现天蓝色阳性反应，而设置的阴性对照及健康组织中提取的DNA样本经反应后没有颜色变化，显示该LAMP体系反应明显、准确、且特异性、灵敏度及稳定性较高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬生疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。

背景技术

在世界范围内已经报道的疫霉约有100种，我国约有27种，随着近几年我国水果及其种苗进口量上升，也大大增加了检疫性疫霉入侵的风险。冬生疫霉(Phytophthorasyringae)、冬生疫霉(P.hibernalis)、栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)、草莓疫霉红心病菌(P.fragariae)、树莓疫霉根腐病菌(P.fragariae)这5种疫霉为我国禁止入境的检疫性疫霉，其中冬生疫霉在澳大利亚西部的柑橘果实上首次被发现，目前主要分布在以色列、土耳其、南非、法国、英国、西班牙、希腊、意大利、美国、葡萄牙、澳大利亚、新西兰、斐济、多巴哥、委内瑞拉，在我国尚未分布，其传播速度快、流行性广、毁灭性高，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，一旦传入我国将对国内水果贸易及出口销售造成巨大障碍。冬生疫霉主要侵染柑橘属及苹果属植物，如脐橙、柠檬、苹果等，可引起果实褐腐；同时还可侵染如甜椒、番茄、玫瑰、杜鹃、贝壳杉等，造成寄主植物枯萎、根腐或溃疡。该病菌属于低温型有害病菌，其卵孢子可在发病组织和土壤中越冬，第二年气温上升、雨量增加时开始活动，其孢子囊会释放游动孢子随雨水飞溅到近地面的果实上并从伤口侵入从而导致果实发病造成大量脱蒂落果。该种疫霉在寒冷高湿季节危害严重，在田间及贮运期间均能发病，发病果实腐烂后易引起与其他病菌如酸腐病菌和青霉菌的复合侵染，大大增加了检疫及防治难度。冬生疫霉属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。冬生疫霉引起的植物病害分布广泛，所以建立冬生疫霉的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。

传统的冬生疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在冬生疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，冬生疫霉的检测国内外均未见报道。

发明内容