[发明专利]用于区分HIV-1新近与慢性感染的免疫吸附检测方法

权利要求书

1.一种融合表达蛋白，其特征在于：用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染，由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，融合表达B-P57、07BC-P57、01AE-P57和D-P57四个肽段，所述融合表达蛋白的氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN。

2.一种试剂盒，其特征在于：以权利要求1所述的融合表达蛋白作为检测抗原，用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染。

3.权利要求1所述的融合表达蛋白在制备用于筛分HIV-1 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和D五种基因亚型血样新近和慢性感染的试剂盒中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述试剂盒通过免疫吸附检测方法来区分HIV-1新近和慢性感染，所述免疫吸附检测方法包括以下步骤：

S1.分析目标HIV的基因亚型，各亚型最优的检测抗原之间由蛋白连接肽GGGGSGGGGS连接，再对应合成碱基序列并在5’端和3’端分别加上酶切位点，通过酶切连接的方式构建重组质粒；

S2.将重组质粒转化至大肠杆菌，在其中大量诱导融合表达目的蛋白，并进行纯化回收、定量测定、低温保存备用；

S3.将融合表达蛋白作为检测抗原固定至固体支持物上，所述融合表达蛋白的氨基酸序列为EAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNSSWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQKFLGLWGCSGKIICTTAVPWNSTWSNGGGGSGGGGSEAQQHLLQLTVWGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGIWGCSGKHICTTNVPWNSSWSN；

S4.通过封闭液进行封闭；

S5.将待测样本加入一起孵育，待测样本中的特异性抗HIV抗体与检测抗原形成抗原-抗体复合物附着在固体支持物表面，洗去没有结合的样本；

S6.加入8M尿素37℃孵育30min，去除非特异性结合或低亲和力抗体，洗涤；

S7.加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体孵育，与待测样本中的特异性抗HIV抗体结合，洗去没有结合的抗体；

S8.将辣根过氧化物酶的底物加入固体支持物中，孵育一定时间后用2M 硫酸终止，使用酶标仪测定各孔光密度强度，判断待测样本为新近或慢性感染；

其中，融合表达蛋白碱基序列的5’端和3’端分别加上的酶切位点为BamHI和XhoI；重组质粒所用表达载体为pET-28a；大肠杆菌为BL21(DE3)。