[发明专利]枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途

说明书

本发明公开了一种枸杞基因以及其编码蛋白质、重组载体、及其用途。所述枸杞基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或宿主细胞。本发明还公开了所述的基因在调控花青素合成中的应用，以及一种调控植物中花青素合成的方法。本发明选用黑枸杞LMH1号与红枸杞Ningqi7号果实转录组测序，分析预测出控制黑枸杞黑色果实性状的主效基因，对研究枸杞花青素合成机制提供了基础。也为基因工程手段改造植物从而提高花青素的含量提供了方向和靶点。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及调控花青素合成与代谢的基因AN2，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。

背景技术

黑枸杞是我国西北荒漠地区一种特有的野生植物资源。在藏药经典著作《晶珠本草》中黑枸杞是一种传统的中草药，在中国已使用数千年历史，它可用于治疗心脏病、月经不调以及更年期等(J.Zheng等，2011)。黑枸杞植株具有抗旱性和耐盐性的特殊生理特点，能够防止土壤沙化缓解土壤盐渍化程度，这对边缘地区的生态系统和农业都非常重要(H.Zhang等，2007)。在黑枸杞的果实中花青素含量可以达到3.1％。矮牵牛花色素占到总花青素的95％，飞燕草色素和锦葵色素占剩余的5％。对于人类健康，花青素被认为具有抗炎、抗突变、抗癌和抗氧化等功效(C.S.Bowen-Forbes等，2010；L.S.Wang等，2008；G.Mazza.，2007)。药理实验证明，黑枸杞具有抗疲劳、降血糖和抗氧化等功效(W.Feng等，2010；J.H.Wang等，2007)。虽然对其化学成分和药理性质已经进行了研究，但是黑枸杞果实中花青素含量高的分子遗传机制尚不清楚。

花青素的生物合成途径在模式植物中已有几十年的研究。由于易于观察的特性，花青素合成代谢调控通路是研究得较为清楚的次生代谢通路(林泉,1998)。花青素的合成首先由苯丙氨酸经过三步酶促反应生成香豆酰CoA，1分子的香豆酰CoA和3分子丙二酰CoA在查尔酮合成酶(CHS)催化下生成查尔酮，查尔酮很少积累，在查尔酮异构酶(CHI)的催化下，很快异构化形成柚皮素(黄烷酮)。黄烷酮在类黄酮-3-羟化酶(F3H)催化下，C环位置3羟化形成二氢黄酮醇。二氢黄酮醇是其它两种酶B环羟化酶即F3'H和F3'5'H的底物。F3H、类黄酮-3'-羟化酶(F3'H)、类黄酮-3',5'-羟化酶(F3'5'H)同属P450超家族。由F3H、F3'H、F3'5'H三种羟化酶所催化反应的产物是合成花色素苷的直接前体。二氢黄酮醇被羟化的程度和位置不同，将决定最终合成的花色素苷的种类，从而决定花、种子、果实的颜色。从二氢黄酮醇转变成花色素苷的反应非常复杂，需要几个不同酶的作用(Johnson等，2001)。ANS是双加氧酶，催化从无色花色素到花色素的转变。不稳定的花色素形成后，进一步糖苷化形成稳定的花色素苷(Mato等，2001)。此外MYB、bHLH和WD40三个转录因子对花青素合成基因具有调控作用之间的关系(Koes等，2005)。一些MYB基因能够调控bHLH转录因子的表达，进而形成一个包含WD40蛋白的复合体。WD40是不是出现在这个启动DFR复合体中还存在些疑问。MYB能够直接结合到DNA上，而bHLH很可能是通过一个假想的结合蛋白与DNA结合。小的R3-MYB很可能能与bHLH蛋白结合，从而阻止其进入转录启动复合体，启动DFR的转录(Zhang等，2014)。

通过实时聚合酶链式反应，已经对黑枸杞中花青素的积累进行了比较分析，但这些与花青素合成相关的基因是从叶片转录组数据库中获得(S.Zeng等，2014)，这意味着某些在果实中特异表达的基因应该是被遗漏掉了。此外，宁夏枸杞和黑枸杞在茄科家族中属于不同种类。有必要评价宁夏枸杞和黑枸杞的果实中结构基因的结构差异及其调控因子，并比较它们的转录水平。