[发明专利]一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法

权利要求书

1.一种柑橘类果肉线粒体的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)将柑橘果肉与缓冲液A按照1g:1～5mL的料液比混合后榨汁，固液分离得过滤液；所述缓冲液A为包括以下成分的水溶液：0.3～0.5M的山梨醇、0.15～0.5M的3-(N-玛琳代)丙磺酸、1～10mM的乙二胺四乙酸、1～10mM的二硫苏糖醇、质量体积比为1～5％的聚乙烯吡咯烷酮和质量体积比为0.05～1％的牛血清蛋白；所述缓冲液A的pH值为7.5～8.0；

2)将步骤1)得到的过滤液进行差速离心，所述差速离心后得到的沉淀用缓冲液B进行悬浮，得到样品I；所述缓冲液B为包括以下成分的水溶液：0.3～0.5M的山梨醇和20～60mM的3-(N-玛琳代)丙磺酸；所述差速离心的次数为两次；

所述差速离心的步骤包括：

a)将所述过滤液在1000～1800g离心力下进行第一离心，收集第一上清液；

b)将所述第一上清液在2500～5000g离心力下进行第二离心，收集第二上清液；

c)将所述第二上清液在10000～17000g离心力下进行第三离心，收集沉淀；

3)将步骤2)得到的样品I与用缓冲液C稀释的Percoll梯度稀释液混合，进行密度梯度离心，收集线粒体层，得到样品II；所述缓冲液C为包括以下成分的水溶液：0.6～1.0M的山梨醇和40～120mM的3-(N-玛琳代)丙磺酸；

4)将步骤3)得到的样品II与所述缓冲液B混合，离心后收集沉淀，得样品III；

5)将步骤4)得到的样品III与所述缓冲液B混合，离心后收集沉淀，得柑橘果肉线粒体；

所述柑橘包括橙、柑、橘或柚；

步骤2)、步骤4)及步骤5)所述缓冲液B的pH值独立地为7.2～8.0；

所述用缓冲液C稀释的Percoll梯度稀释液中Percoll的体积分数为35％、22.5％和18％；

所述缓冲液C的pH值为7.2～7.8；

步骤3)所述密度梯度离心的转速为18000～22000rpm，时间为40～80min；

步骤4)和步骤5)所述离心的离心力独立地为12000～17000g，时间独立地为12～20min。