[发明专利]基于RT-WES的转录组测序方法

说明书

本发明公开了一种基于RT‑WES的转录组测序方法，步骤包括：1)提取样本总RNA；2)以总RNA为模板合成cDNA；3)构建cDNA片段化文库；4)对所述片段化文库进行全外显子捕获，富集功能基因的转录组片段；5)对所述转录组片段测序并分析测序数据。本发明采用反转录‑全外显子组测序技术，通过cDNA合成过程，先将RNA转化成DNA，再通过全外显子捕获来富集外显子信息，获得rRNA和基因组DNA干扰少、功能基因表达富集高、背景低的转录组测序数据，如此降低了对RNA的质量和起始量的要求，免去了去除rRNA干扰的步骤，为突变基因转录本表达变化分析提供了更为精准高效的途径。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及转录组的数据获得和分析技术，更具体的说，是涉及一种基于逆转录-全外显子捕获技术(RT-WES)的转录组测序方法。

背景技术

转录组是在某一特定发育时期或某一生理条件下，一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和。转录组分析是研究细胞表型和功能的一个重要手段。目前常规的转录组分析方法主要有基于杂交技术的生物芯片(包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片)技术和基于序列分析的RNA测序技术。其中：

生物芯片技术是半定量杂交分析技术，只能分析不同基因转录本表达高低，无法同时大量地分析组织或细胞内基因组表达的状况，而且由于芯片技术需要准备基因探针，所以可能漏掉那些未知的、表达丰度不高的、但可能很重要的调节基因，因此已无法满足现代肿瘤学研究的需求。

RNA测序技术(RNA-seq)的优点是：可以定量分析转录本表达量的变化；在肿瘤学研究中，可以通过RNA突变获得突变基因表达的信息，并有效准确地获得融合基因是否存在的信息。缺点是：对样本RNA的质量和起始量要求高(要求RNA完整性RIN>7，起始量>2μg)，需要使用新鲜组织来源的RNA。由于新鲜组织保存困难，临床经常没有新鲜组织样本，只有石蜡切片，而从石蜡切片中获得的RNA，其RIN值，好的小于3，差的根本无法评估，因此，对于临床样本，特别是石蜡切片白片来源的RNA，采用传统RNA-seq技术无法直接建库并获得有效数据，即使使用更多的数据量来进行分析，效果仍然不佳，而成本却会提高很多。

外显子组(exome)，即一个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列(外显子)的总和。全外显子捕获技术，目前常规只用于基因组DNA的外显子部分的捕获富集。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于RT-WES的转录组测序方法，它可以降低对样本RNA的质量和起始量的要求，并可以提高转录组测序数据的信噪比。

为解决上述技术问题，本发明的基于RT-WES的转录组测序方法，包括以下步骤：

1)提取样本总RNA；

2)以所述总RNA为模板，合成cDNA；

3)构建cDNA片段化文库；

4)对所述片段化文库进行全外显子捕获，富集功能基因的转录组片段；

5)对所述转录组片段进行测序并分析测序数据。

上述步骤1),所述样本可以是RNA质量较差、总量较低的临床样本，例如用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织样本。

上述步骤2)可以进一步包括以下步骤：21)以所述总RNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成cDNA的第一链；22)以所述第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成cDNA的第二链。

其中，步骤21)，逆转录反应体系优选为包括以下组分：100-500ng总RNA 13.5μl，50ng/μl随机引物1μl，5X第一链合成反应缓冲液4μl，RNase抑制剂0.5μl，200U/μl逆转录酶1μl，总体积20μl。逆转录反应条件优选为：25℃10分钟；42℃50分钟；70℃15分钟；4℃保持。