[发明专利]一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法

说明书

本发明公开了一种采用植物微组织直接RT‑PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：(1)模板RNA提取和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位(茎、叶柄或根)，并停留2‑3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果；本发明方法不需要单独步骤来分离提取待检测样品的RNA，能在较短的时间内制备用于PCR反应的RNA模板，方便快捷，且不需要仪器设备；广谱性高，可检测多种植物病毒，大大提高植物病毒检测的效率和准确性。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，尤其涉及一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法。

背景技术

为了防止植物病毒在国家和地区之间的移动，控制植物病毒性疾病，植物病毒检测在检疫检查中是必要的。长期以来，人们一直致力于开发简单有效的植物病毒检测方法，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(James et al.,2006)、real-time RT-PCR(Mirmajless et al.,2015)和逆转录环介导等温扩增(RT-loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP，Lu et al.,2018)，微阵列(Liu et al.,2017)和下一代测序(Jones et al.,2017)。其中，由于其灵敏度高且操作较简便，RT-PCR的方法已广泛应用于病毒检测(James et al.,2006；Jan et al.,2011)。

现有的RT-PCR检测植物病毒的过程中，RNA模板的制备需要RNA的分离和纯化。RNA的分离是一项技术性强、耗时长的工作，需要一定量的植物材料和离心步骤。RNA提取后，必须对RNA提取液进行纯化，以获得高质量的RNA。在这些步骤中，操作人员的技术错误可能导致RNA污染或降解，从而导致错误的检测结果(James et al.,2006；Jan et al.,2011)。即目前的RT-PCR检测植物病毒存在模板RNA制备较困难、检测速度较慢、检测效率较低、准确度较差、成本高等缺点。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种采用植物微组织直接逆转录聚合酶链反应快速检测多种植物病毒的方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种采用植物微组织直接RT-PCR检测多种植物病毒的方法，依次包括以下步骤：

(1)模板RNA的制备和逆转录：在实体显微镜下，用无菌注射器针刺入待检植物组织样品的某一部位，并停留2-3秒，然后将带有植物微组织的无菌注射器针尖直接浸入逆转录混合物中进行反应，以便进行逆转录，得到cDNA；

(2)PCR反应：将步骤(1)得到的cDNA进行PCR反应，得到反应产物；

(3)结果判断：将步骤(2)所得的反应产物进行电泳分析，得到检测结果。

本申请的发明人通过大量实验发现，采用无菌注射器针取样所粘附的植物汁液中含有微量植物病毒RNA，这些植物病毒RNA在RT反应液即逆转录反应液中被逆转录酶通过随机引物逆转录为cDNA(这时的cDNA有植物病毒的，也有植物组织的)，然后在PCR反应液中加入针对待检测植物病毒靶基因序列的引物，在该对引物的引导下，DNA聚合酶只扩增植物病毒RNA靶基因序列，从而可以排除样品中其他DNA和蛋白等的干扰，即可以免去RNA样本的分离提取步骤，也能消除DNA等对于RT-PCR的影响，从而大大提高检测效率和准确性。

本申请的方法，又称为植物微组织直接逆转录聚合酶链反应(microtissuedirect reverse transcription-polymerase chain reaction)，即MD RT-PCR法。