[发明专利]PLA2抑制剂编码基因的克隆方法

权利要求书

1.PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，从中华大蟾蜍皮肤cDNA文库中克隆获得的SEQ ID No.1、SEQ ID No.3，并将SEQ ID No.1翻译得到氨基酸序列 SEQ ID No.2，将SEQ ID No.3翻译得到氨基酸序列为SEQ ID No.4；

步骤二，采用PCR扩增：

（1）PCR的模板为中华大蟾蜍第一链cDNA；PCR的引物：上游引物序列：5′-GGATTTGGTCCACTGCAAAC-3′，下游引物序列：5′-CTGACAACCGGAGACACAG-3′，浓度均为2pmol/μL；

（2）PCR反应体系为30μL，其中10×Buffer：3μL；10 mmol/L dNTPS：1.5μL；上、下游引物各1.5μL；模板DNA：0.2μL；5 U/μL Taq：0.3μL；灭菌纯水21.7μL；

（3）Taq DNA聚合酶PCR扩增中华大蟾蜍PLI基因片段的PCR程序：95℃变性/20 s，58℃退火/20 s，72℃延伸反应/1 min 30 s，40 个循环。

2.根据权利要求1所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于：步骤一中的cDNA来自于中华大蟾蜍的皮肤、脑、心、肝、肺、胰、胃、肠、肾、精巢、输卵管、脾中的任一部位。

3.根据权利要求1或2所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于：克隆过程所列基因序列、基因序列翻译的氨基酸、基因序列翻译的氨基酸所构成的蛋白多肽均可应用于抑制剂的制备。

4.PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，从日本蟾蜍皮肤cDNA文库中克隆获得的SEQ ID No.5，并将SEQ ID No.5翻译得到氨基酸序列为 SEQ ID No.6；

步骤二，采用PCR扩增：

（1）PCR的模板为日本蟾蜍第一链cDNA；PCR的引物：上游引物序列：5′-GGATTTGGTCCACTGCAAAC-3′，下游引物序列：5′-CTGACAACCGGAGACACAG-3′，浓度均为2pmol/μL；

（2）PCR反应体系为30μL，其中10×Buffer：3μL；10 mmol/L dNTPS：1.5μL；上、下游引物各1.5μL；模板DNA：0.2μL；5 U/μL Taq：0.3μL；灭菌纯水21.7μL；

（3）Taq DNA聚合酶PCR扩增日本蟾蜍PLI基因片段的PCR程序：95℃变性/20 s，58℃退火/20 s，72℃延伸反应/1 min 30 s，40 个循环。

5.根据权利要求4所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于：步骤一中的cDNA来自于日本蟾蜍的皮肤、脑、心、肝、肺、胰、胃、肠、肾、精巢、输卵管、脾中的任一部位。

6.根据权利要求4或5所述的PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，其特征在于：克隆过程所列基因序列、基因序列翻译的氨基酸、基因序列翻译的氨基酸所构成的蛋白多肽均可应用于抑制剂的制备。