[发明专利]一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法。具体地，本发明公开了一种重组质粒，还公开了包含前述重组质粒的重组酵母菌，以及它在制备预防H7N9病毒感染的疫苗中的用途。本发明已经成功建立了包含H7N9病毒部分基因片段的重组酵母EBY100/pYD1‑HA，而且证实了HA可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对H7N9病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

技术领域

本发明涉及一种预防H7N9病毒感染的口服疫苗及其制备方法。

背景技术

2013年3月，中国疾病控制中心证实，一种全新的禽流感病毒H7N9亚型出现在中国大陆。截止至2016年2月25日，中国内地共有人感染H7N9禽流感病毒1295例，其中249例死亡，致死率达20％。H7N9亚型如其它A型禽流感病毒一样，其基因组由8 股负链的单链RNA片段组成，共编码10个病毒蛋白，其中主要表面抗原成份是血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuramidinase,NA)。尽管H7N9病毒尚不具备人际传播的能力，但是由于其能够特异性地结合人上呼吸道的α2-6唾液酸受体，所以在H7N9 病毒不断发生突变的情况下发生，具备人传人的潜能。因此，我国对H7N9病毒的防控必须时刻保持清醒，并采取有效的措施予以应对。毋容置疑，接种疫苗是预防H7N9病毒感染的最有效的措施之一。

目前，人用H7N9禽流感疫苗的研发，与其它人用流感疫苗一样，主要采用灭活或裂解工艺生产。然而，无论是传统的灭活疫苗、减毒疫苗还是通过哺乳动物细胞制备的H7N9流感疫苗都需要对活病毒进行操作，并且需要严格的生物安全三级实验室(BSL-3)的设施。

疫苗的核心是安全性、有效性和时效性。如何在三者之间找寻一个平衡点，是科研工作者需要直面的一个的挑战。目前已经报到的人用H7N9禽流感疫苗的安全性均较差，而安全性较好的有效性和时效性往往又较差。需要研发能够兼顾安全性、有效性和时效性的H7N9疫苗。

发明内容

本申请基于高效、稳定以及安全的酿酒酵母(S.cerevisiae EBY100)表面展示系统，以A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)的HA、NP和M2蛋白作为主要研究对象，通过pYD1构建酿酒酵母C-末端表面展示系统(EBY100/pYD1-HA，EBY100/pYD1-NP，EBY100/pYD1-M2。同理，通过pYD5构建酿酒酵母N-末端展示系统(EBY100/pYD5-HA，EBY100/pYD5-NP， EBY100/pYD5-M2)。以雪貂(ferret)作为动物模型，在不使用佐剂的情况下，通过肠溶胶囊包裹经冷冻干燥后的不同组分、不同比例的酿酒酵母表面展示系统进行口服免疫。检测机体的体液免疫应答水平、细胞免疫应答水平和黏膜免疫水平。通过不同亚型的H7N9 病毒或异型的H5N1和H1N1进行攻击分析，检测酿酒酵母表面展示系统作为H7N9流感疫苗递送载体的交叉免疫保护效率。与此同时，考察并比较酿酒酵母C末端表面展示系统和N末端表面展示系统的免疫保护效果，最终研发出以酿酒酵母表面展示系统为基础的临床前期人用H7N9流感疫苗，并建立可以实际应用的流感疫苗口服递送技术平台。为我国防控H7N9及其它流感病毒(如H5N1、H1N1等)提供可行的免疫参考和技术储备。

具体地，本发明提供了一种重组质粒，它含有A/Anhui/1/2013(AH-H7N9)具有交叉反应性的HA茎结构域(基因库编号：CY187618)、核蛋白(NP)(基因库编号：CY187621，基因长度：1497bp)或离子通道蛋白(M2)(基因库编号：CY187619.1，基因长度：291bp) 所述核苷酸序列的重组pYD1质粒或者重组pYD5质粒。

所述SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所述核苷酸序列位于pYD1 质粒的C端，或者位于pYD5质粒的N端；优选地，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO： 4～6任意一项所示。