[发明专利]基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法

权利要求书

1.基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建双末端测序所需的测试序列：在单链免疫基因上引入扩增引物和UMI标记序列，进行PCR扩增，得到测试序列；

（2）剔除不完整的测试序列：根据是否带有UMI和引物分离步骤（1）所得的测试序列，保留含有UMI和引物的测试序列，去除不带引物或UMI的测试序列；

（3）测序质量控制：根据测序质量值对步骤（2）中保留下来的测试序列进行过滤；

（4）UMI自身校正：根据不同UMI序列之间的汉明距离和每个UMI所标记的免疫基因序列的种类数，将步骤（3）所得的测试序列分成不同的团簇，团簇的数目就是纠正后UMI的种类数；

（5）每个团簇中免疫基因的数目统计：纠正前各个UMI所标记的免疫基因序列的种类数之和就是该UMI所在团簇的免疫基因序列的种类数；

（6）每个团簇中免疫基因序列的校正：对同一个团簇中的免疫基因序列采用多序列对比软件muscle进行相互之间的序列对比，如果某个位点的一致性碱基的比例大于0.6，则该位点为该一致性碱基，反之用N代替，得出每个团簇中免疫基因的序列；

（7）免疫基因序列组装：将各个团簇上的免疫基因进行组装；

（8）统计免疫基因的真实表达量：对步骤（7）中组装好的免疫基因序列进行过滤，除去没有组装序列，并分析不同团簇中免疫基因的相似性，如果一致，则合并，并记录相关的数目信息，即为该基因的真实表达量；

（9）统计与报告：采用igblast进行数据库比对注释，分析注释结果分别统计有功能的和没有功能的基因类型。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中的UMI是结构为UNNNNUNNNNUNNNNU的四个U碱基框架，两两U碱基之间包含四个随机的碱基，该UMI理论种类有4¹²种。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中的免疫基因是免疫球蛋白M基因、免疫球蛋白G基因、免疫球蛋白A基因、免疫球蛋白D基因和免疫球蛋白E基因中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（1）中在且仅在单链免疫基因的一端添加引物和UMI序列，且单链免疫基因3’端和5’端添加相同结构的UMI序列，一条3’端带有引物和UMI的免疫基因序列和一条5’端带引物和UMI的相同序列的免疫基因序列称为一对测试序列。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（3）对整个测试序列进行测序，通过过滤，保留测序质量值在20以上的测试序列。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（4）中UMI自身校正过程包括以下步骤：

①建树：将不同的UMI作为不同的节点，连接汉明距离为1的UMI节点，建成多棵有向无环树；

②赋值：对步骤①中建成的有向无环树的节点进行赋值，所赋数值为该UMI所标记的免疫基因序列的种类数；

③砍树：当节点A所赋数值大于与之相连的节点B所赋数值×2+1时，砍除节点A和节点B之间的边；反之，则保留节点A和节点B之间的边；

④形成团簇：对步骤①中所建树上的每个节点都进行步骤③所述的操作，最终将步骤①中所建树分割成多棵新的树，每棵新树就是一个团簇。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（7）中的组装，对于全长测序，则根据末端重叠区域进行拼接。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（7）中的组装，对于非全长序列，采用比对imgt数据库中参考序列的方法进行拼接。

9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（7）组装的过程中，基因序列存在缺失现象时，根据imgt数据库中的参考序列对缺失部分进行填充。

10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤（9）中有功能的基因是指免疫基因中的核酸长度是3的倍数且不含终止密码子的CDR3区基因。