[发明专利]脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。该脂肪组织消化液由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。本发明提供的脂肪组织消化液可使消化体系能够稳定维持在pH6.8～8.2之间，使I型胶原酶活性达到最佳，从而实现短时间消化完全。传统消化方案得到的SVF耗时40min，而采用本发明消化液对脂肪组织进行消化，可以在15～20min内获得高质量和数量的SVF。

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。

背景技术

难愈性创面在外科疾病中是常见病，具有病程长、并发症多、对外观影响大的特点，近年来有逐年增多的趋势，成为严重影响患者生活质量的因素。如何促进难愈性创面愈合是一直被探索的问题，然而到目前为止仍没有一种理想的方法。间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中，它是一种具有多向分化潜能的细胞，具有促进组织再生的潜能。MSCs能通过促进局部组织的血管形成及组织再生从而加速创面的愈合。但是由于骨髓中的MSCs含量较低而且提取困难而限制了骨髓来源的MSCs在临床中的应用。近期的研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs，而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点。而且脂肪中的干细胞含量、细胞的扩张及增殖能力都明显优于骨髓组织。

基质血管成分细胞(SVF)是从脂肪抽吸的颗粒中发现的含有脂肪源性的再生细胞，其中有30％以上为脂肪源性干细胞。SVF是脂肪组织通过消化、过滤、离心去除成熟的脂肪细胞后得到的。2001年Zuk首次发现SVF包含多种细胞成分，包括MSCs、内皮前体细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等成分，而且可以诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等。

近期的研究认为SVF可以通过分化成血管内皮细胞、分泌促血管形成及抗凋亡的生长因子等多方面来促进难愈性创面的愈合。在移植脂肪的过程中添加SVF，发现它的作用非常可观：能提升脂肪细胞的成活率，而且它还能明显改善皮肤质地，对移植部位有很好的修复作用，同时缓解敏感。

目前获得SVF的常规方法是采用一定浓度的I型胶原酶恒温震荡消化。常规的分离方法采用终浓度0.25％的I型胶原酶消化需要约40min得到SVF。每毫升脂肪通过胶原酶的消化可获得1.0～2.5×10⁵的SVF，活率在70％～85％。可见常规获取基质血管成分细胞的时间较长，且活率较低。因此，需要提供一种消化时间更短、细胞活率更高的消化方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。该方法可快速获得基质血管成分细胞，将时间缩短至15～20min，同时细胞活率也得到了显著提高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脂肪组织消化液，由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。

传统的消化方法中并未关注消化过程中体系pH的变动，本研究发现常规方法中I型胶原酶并不是处于最佳pH环境，所以得到SVF时长较长。本发明方法在消化体系中添加HEPES缓冲液的缓冲体系，使消化体系能够稳定维持在pH6.8～8.2之间，使I型胶原酶活性达到最佳，从而实现短时间消化完全。传统消化方案得到的SVF耗时40min，而本发明添加有额外缓冲成分的消化方案可以在15～20min内获得高质量和数量的SVF。

作为优选，消化液中各组分的用量为：

I型胶原酶：0.1wt％～0.3wt％；

HEPES缓冲液：1～30mM；

DMEM/F12培养基：补足。

优选地，消化液中各组分的用量为：

I型胶原酶：0.25wt％；