[发明专利]抗人B7-H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒

说明书

本发明公开了一种抗人B7‑H4单克隆抗体、抗人B7‑H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒，本发明的抗人B7‑H4单克隆抗体以及这株单克隆抗体可用于免疫组化标本检测及肿瘤组织B7‑H4表达分析，并从分泌抗人B7‑H4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，测序验证B7‑H4重轻链可变序列。在此基础上实施真核细胞株表达抗体，所获抗体经验证具有良好的结合能力，采用免疫组织化学检测对肿瘤标本特异性染色，并比较自行研制的B7‑H4单抗与商品化B7‑H4抗体对同一组织标本染色的效果和特异性。

技术领域

本发明涉及一种抗体免疫组化的检测应用，以及抗体重链可变区和轻链可变区序列的验证，属于生物技术领域，特别涉及抗人B7-H4单克隆抗体、鉴定方法、应用和试剂盒。

背景技术

近年来，越来越多的研究发现，B7-H4分子异常表达在各种肿瘤组织，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌等。临床回顾性病例分析发现，B7-H4的表达与临床病理学特征存在相关性，通过生存分析发现高表达B7-H4的病例预后差，死亡率高，并且在肿瘤患者外周血中也发现了高水平的可溶性B7-H4（sB7-H4）。此外，研究还发现，B7-H4与移植免疫排斥和自身免疫病理相关，转染了B7-H4基因的移植物可以抑制宿主T细胞的活性，从而延长移植物的生存时间。这些研究结果都提示，B7-H4是个重要的负性共刺激分子，具有重要的研究和运用价值。

人类很多肿瘤中，B7-H4在mRNA和蛋白水平上均有表达并且与病人的预后呈负相关。B7-H4异常表达于肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中，并和年龄、病理类型、肿瘤生物学效应和患者生存率密切相关，因此，研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体可以为进一步研究该分子在肿瘤中的作用奠定物质基础，同时也为探明B7-H4信号传导通路及机制提供有效的研究手段，有功能的抗人B7-H4单克隆抗体更有望成为肿瘤生物治疗的潜在靶点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗人B7-H4单克隆抗体；

本发明的目的之二是提供一种抗人B7-H4抗体重链和轻链可变区序列的鉴定方法。本发明从分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，根据测序结果保留候选的重轻链可变区序列，PCR扩增出与表达载体匹配的重链、轻链可变区序列，将PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a。连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，培养收获的上清含有目的抗体，证明得到的重链和轻链可变区序列正确；

本发明的目的之三是提供一种抗人B7-H4单克隆抗体用于免疫组化检测组织标本，发现用该抗体B7-H4对肝癌组织标本组织进行组化染色，胞膜和胞浆均有明显着色；进一步用于免疫组化的病理标本检测，结果显示B7-H4在肠癌病人间质细胞的胞浆和细胞核及肠癌细胞的胞膜呈高表达。

本发明的目的之四是提供一种利用上述抗人B7-H4单克隆抗体制备的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

作为本发明的第一方面一种抗人B7-H4单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，所述重链可变区(mVH)的氨基酸序列与SEQ ID NO.1相同，具体如下：

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLDWMGYISYSGDTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARDYGSGAWYFDVWGAGTTVTVSS；

所述轻链可变区(mVL)的氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同，具体如下：

DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK。