[发明专利]一种精华素及其精华素和复合干细胞因子冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种复合干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.将新生儿的脐带转移到无菌培养皿中，加入PBS缓冲液，浸泡至脐带发白无血迹；

B.取步骤A中浸泡过的脐带，将其剪成1-10cm的脐带，将所述脐带的1根脐静脉、2根脐动脉和脐带外表皮剥离丢弃，保留剩下的华通氏胶部分；

C.取步骤B的华通氏胶，将所述华通氏胶剪碎成0.5-2mm³的小块；

D.将步骤C中的华通氏胶小块铺设于新的培养皿底部，华通氏胶小块间的距离为0-5mm；

E.在步骤D的培养皿中加入0.5-1.5mL无血清培养基，倒置培养皿，然后将培养皿放到饱和湿度培养箱中，在30℃-40℃的温度下，采用体积份数为4-6％二氧化碳的环境下培养1-2天；

F.将步骤E培养后的培养皿翻转正置，向培养皿中补充完全培养基8-12mL，然后将培养皿放到饱和湿度培养箱中，在30℃-40℃的温度下，采用4％-6％二氧化碳的环境下培养6-11天；

G.将步骤F中培养皿中的培养基进行全量换液，吸取原培养基，将原培养基收集到无菌储液瓶当中，然后在培养皿中加入新鲜的培养基；

H.每2-4天重复步骤G，直到细胞生长至80％融合时为止；

I.将步骤H中的培养皿中的华通氏胶小块和非贴壁细胞弃去，用工程化重组胰蛋白酶消化液消化细胞，按1：5比例传代，每2-4天重复步骤G的操作，直到传代到第三代细胞汇合率达到70％-80％时终止重复步骤G的操作；

J.将步骤I得到的培养皿中的培养液转移到离心管中，在1800-2300r/min的转速下离心9-11min；

K.取步骤J中得到的上清液，加入海藻糖，搅拌溶解；

L.将步骤A配制的复合上清液转移至生物安全柜中，使用0.4-0.5μm的滤器过滤上清液，得到的滤液再用0.2-0.25μm的滤器过滤，得到的滤液存储在硬质冻干瓶中；

M.将步骤L的硬质冻干瓶使用冷冻机冷冻,得复合干细胞因子冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种复合干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤A中的PBS溶液为10mL,步骤B中脐带剪成5cm,步骤C中所述华通氏胶剪碎成1mm³的小块，步骤E中加入1mL无血清培养基，在37℃的温度下，采用5％二氧化碳的环境下培养1天，步骤F中向培养皿中补充完全培养基10mL，在37℃的温度下，采用5％二氧化碳的环境下培养7天，步骤H中每3.5天重复步骤G，步骤I中每3.5天重复步骤G，步骤J中在2000r/min的转速下离心10min，步骤L中使用0.45μm的滤器过滤上清液，得到的滤液再用0.22μm的滤器过滤。

3.根据权利要求1所述一种复合干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，以重量份计，所述步骤K中上清液为0.2-0.6份，海藻糖为2-8份。

4.根据权利要求3所述一种复合干细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，以重量份计，所述步骤K中上清液为0.6份，海藻糖为5份。

5.一种精华素，其特征在于，以重量份计，包括由权利要求1-4任意一项所制备的4.5-5.5份的复合干细胞因子冻干粉、8-16份的PEG-8辛酸或癸酸甘油酯、1-5份的聚甘油-6二油酸酯、0.5-2.5份的肉豆蔻酸异丙酯和70-90份的去离子水。

6.根据权利要求5所述的一种精华素，其特征在于，以重量份计，包括5.34份的所述复合干细胞因子冻干粉、12份的所述PEG-8辛酸或癸酸甘油酯类，2份的所述聚甘油-6二油酸酯，1.4份的所述肉豆蔻酸异丙酯和79.26份的所述去离子水。

7.一种根据权利要求5或6所述的精华素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在室温条件下，向8-16重量份的PEG-8辛酸或癸酸甘油酯类中加入1-5重量份的聚甘油-6二油酸酯，混合摇匀；

2)向步骤1)混匀的溶液中加入0.5-2.5重量份的肉豆蔻酸异丙酯，混合摇匀，加入70-90重量份的去离子水，混合摇匀；

3)无菌条件下，将步骤2)所得溶液过滤后装瓶，得到缓冲微乳精华液；

4)将由权利要求1-4任意一项制备的4.5-5重量份的复合杆细胞因子冻干粉复溶后与得到的缓冲微乳精华液混合，得到精华素。