[发明专利]一种延长皮肤衰老功能改善的组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种延长皮肤衰老功能改善的组合物，其特征在于它的有效成分包括质量百分含量为40～50％的血小板因子、浓度为2～10×10⁷个/mL的成纤维细胞、质量百分含量为20～30％的低分子量透明质酸、浓度为1～10μg/mL层粘连蛋白、浓度为20～50ng/mL的超氧化歧化酶、浓度为5.02mg/mL的葡萄糖酸钠、浓度为2.22mg/mL的醋酸钠、5.25mg/mL的氯化钠、浓度为0.38mg/mL的氯化钾和浓度为0.14mg/mL的氯化镁；

所述的组合物是按照以下步骤进行的：

一、血小板因子制备：

1)采用含有柠檬酸钠抗凝剂的采血袋采全血，在室温下，按照与全血体积比为5～7:1的比例向装有全血的采血袋中加入分子量为400000～700000D的质量百分含量为5.5％～6.5％的羟乙基淀粉溶液，充分混匀后自然沉降1h，将沉降的红细胞弃除，袋中液体混匀后，在800～1100x g的条件下室温离心20min，将袋中上清液上层的2/3排出并收集作为A液；向剩在袋中的液体中加入与剩余液体等体积的含有2μM前列腺素E1、0.4U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，混匀，作为B液；

2)在安全柜中，将体积百分含量为30％Percoll生理盐水溶液置于离心管内，按体积比为2:1的比例加入B液，在室温、300～500x g的条件下离心15～25min；离心后将下层白细胞层去掉，剩余液体在室温、800～1600x g的条件下离心15～25min；离心后将上清液弃掉，沉淀用生理盐水洗涤后，加入体积为采集全血体积1/10的A液，混匀，作为C液；

3)向C液中加入浓度为0.05～5mg/mL的无菌葡萄糖酸钙溶液，混匀后放置于30℃恒温孵育1～4h，取出后在4℃、1500～3000x g的条件下离心15～45min，去除析出的纤维蛋白，作为D液；

4)将盛装D液的离心管置于超声波冰水浴中，先在超声波强度为150～250W/cm²的条件下，处理15～60s，间歇15～60s后，再以300～400W/cm²超声波强度处理15～60s；再经0.22μm针头滤器过滤后，即为不含白细胞、不含纤维蛋白原、无血小板碎片的血小板因子溶液；

二、成纤维细胞制备：

5)将眼皮组织的真皮层切割成0.5～1.5mm²的块，在37℃无菌条件下，用混合胶原酶对皮肤组织进行消化30min后，停止消化；其中，混合胶原酶是由质量百分含量为0.5％的胶原酶I和质量百分含量为0.5％的胶原酶IV混合而成；

6)将消化完成的组织块漂洗3次，接种于培养板底部，且组织块的表皮面朝上，置于培养箱中干涸稳固1-2h后，向瓶内加入含体积百分含量为1～3％的由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使之刚好浸润组织块，然后将培养瓶置于温度为37℃、体积百分含量为5％的CO₂细胞培养箱中培养，培养5～7天后更换新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；待细胞爬出后，每3～5天换一次新鲜含1～3％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液；

7)通过细胞刮刀切割传代法，将组织块连带周围内圈角朊细胞切割、去除，将剩余的成纤维细胞刮散并置于培养板中，加入2mL含体积百分含量为4～5％由步骤一制备的血小板因子溶液的a-MEM培养液，使细胞浓度在4～5×10⁴/mL；待细胞密度达70％，进行传代、扩增，直至培养至P4-P5代，收获细胞；

三、组合物制备：

8)向步骤一制备的血小板因子中，加入透明质酸、层粘连蛋白、超氧化歧化酶、葡萄糖酸钠、氯化钾、氯化钠、三水合醋酸钠和六水合氯化镁，混匀后，得E液；

其中，E液中血小板因子溶液的质量百分含量为40～50％，低分子量透明质酸的质量百分含量为20～30％，层粘连蛋白的浓度为1～10μg/mL，超氧化歧化酶的浓度为20～50ng/mL，葡萄糖酸钠的浓度为5～5.5mg/mL的，醋酸钠的浓度为2～2.5mg/mL，氯化钠的浓度为5～5.5mg/mL，氯化钾的浓度为0.3～0.5mg/mL和氯化镁的浓度为0.1～0.2mg/mL；

9)将步骤二培养的P4-P5代成纤维细胞用质量百分含量为0.25％的胰酶替代物TrypLEExpress在37℃条件下消化2min后，收集细胞，用生理盐水洗涤两次，在180x g的条件下离心5min，弃上清，沉淀即为成纤维细胞；

10)向步骤9)成纤维细胞中加入8)的E液，使得成纤维细胞浓度为2～10×10⁷/mL，即得延长皮肤衰老功能改善的组合物。