[发明专利]人源化CD40基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人CD40基因的第2号外显子部分序列、3号外显子全部序列、4号外显子全部序列、5号外显子全部序列、6号外显子全部序列和第7号外显子的部分序列，所述的方法包括将动物来源的Cd40的第2号外显子的部分、3号外显子的全部、4号外显子的全部、5号外显子的全部、6号外显子的全部和7号外显子的部分序列替换为人CD40基因的第2号外显子的部分、3号外显子的全部、4号外显子的全部、5号外显子的全部、6号外显子的全部和7号外显子的部分序列，所述的人CD40基因的第2号外显子部分序列、3号外显子全部序列、4号外显子全部序列、5号外显子全部序列、6号外显子全部序列和第7号外显子的部分序列如SEQ ID NO：30所示，该人源化动物模型体内可表达人源化CD40蛋白，所述的人源化CD40蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：27所示，同时内源CD40的蛋白表达降低或缺失。

2.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合CD40基因，所述嵌合CD40基因编码人源化CD40蛋白，所述人源化CD40蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合CD40基因编码的胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合CD40基因编码的胞外区域包含人CD40蛋白胞外域的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Cd40启动子后。

3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源部分包括Cd40基因的1号外显子全部序列、7号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD40人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。

5.根据权利要求3所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源的Cd40基因为啮齿类动物来源的Cd40基因，所述啮齿类动物为小鼠。

6.根据权利要求1-3和5任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Cd40的第2号外显子的部分、3号外显子的全部、4号外显子的全部、5号外显子的全部、6号外显子的全部和7号外显子的部分序列替换为人源CD40的第2号外显子的部分、3号外显子的全部、4号外显子的全部、5号外显子的全部、6号外显子的全部和7号外显子的部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

7.根据权利要求1-3和5任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合CD40基因，所述嵌合CD40基因编码人源化CD40蛋白，或所述的嵌合CD40基因选自下列组中的一种：

a）嵌合CD40基因为SEQ ID NO：24所示的序列；

b）嵌合CD40基因的CDS序列为SEQ ID NO：25所示的序列；

c）嵌合CD40基因的mRNA序列为SEQ ID NO：26所示的序列；或，

d）嵌合CD40基因中来源于人CD40基因的部分为SEQ ID NO：30所示的序列。