[发明专利]表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒弱毒株，其插入的外源序列包括：CMV启动子、猪瘟病毒E2蛋白的信号肽及编码E2蛋白第1‑342位氨基酸和SV40 polyA的核苷酸序列。本发明还公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒弱毒株的制备方法和应用。本发明的重组伪狂犬病毒弱毒株，对伪狂犬病毒及猪瘟病毒均有较好的免疫保护效果，适于作为防治伪狂犬病及猪瘟的疫苗候选株。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒 株及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,该病全球流行，对养猪业危害严 重，是各国防控和检疫的重要传染病。自从成功研制并广泛应用猪瘟疫苗(C株)以来，猪 瘟在我国得到了有效控制，鲜有大面积的爆发。但是，我国并未消灭猪瘟，且近十几年来， 猪瘟仍在全国范围内流行，而且流行态势日趋复杂，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。 中国研制的猪瘟疫苗(C株)是世界公认的优秀疫苗，但在中国复杂的养殖环境下，虽然采 取了猪瘟疫苗强制免疫防控策略，但猪瘟病毒在我国仍然广泛流行。

目前，很多国家采用猪瘟弱毒疫苗免疫来控制猪瘟，但弱毒疫苗最大的缺陷是用血清学 方法无法区分免疫猪群与野毒感染的猪群，不利于猪瘟的根除。而一部分国家采用的非免疫 清除策略，要对感染猪群实施扑杀策略，这种策略也面临经济损失和防控风险，而且不适于 我国的国情。猪瘟标记疫苗免疫(在血清学上可以与野毒感染猪相区分)与清除措施相结合是 世界公认的控制猪瘟最理想的方法。

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为 主要特征的一种烈性传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者 和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪 高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA， 长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋 白。病毒粒子由核衣壳、外壳及囊膜三层组成。核衣壳是由6种衣壳蛋白包裹病毒基因组形 成的二十面体结构；外壳介于核衣壳与囊膜层间，由14种蛋白组成；囊膜由15种蛋白镶嵌 于双层脂膜组成，其中糖蛋白11种。病毒表面蛋白决定了病毒的细胞嗜性，也是主要的保护 性抗原。一些重要的病毒基因，如tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。

伪狂犬最早发生于美国，我国于上世纪40年代末在猫中首次发现了PRV，60年代初在 猪群中也出现了该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健 康，并造成了严重经济损失。猪感染PRV后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒；出现临床 症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRV Bartha-K61株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武、彭金美等人也分别从发病猪中分离到了PRV野毒株，并通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离 的野毒株较疫苗株和经典毒发生了较大的变异。这表明，我国猪场中出现了PRV变异株，而 目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果差，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头。