[发明专利]一种非组织培养的玉米遗传转化方法

权利要求书

1.一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将含目的基因的质粒导入农杆菌感受态细胞：取2ul含目的基因的质粒于0.2ulEP管中，向质粒中加入20ul的农杆菌感受态细胞，轻柔混匀内容物盖好管盖，在冰中静置5min后放入液氮中放置5min，接着37℃放置5min，快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却5min，向每支EP管加入100μl不含抗生素的LB液体培养基，将0.2ulEP管转移到28℃摇床，培育2-3h使抗性基因表达，此时取出含利福平和链霉素的LB固体培养基放置到超净工作台中，重悬菌液，取60ul将其涂于含利福平和链霉素的LB固体培养基上，放置晾干，将平板倒置于28℃培养箱中，培养2d；

S2、玉米幼胚的制备：取授粉后10d-15d的玉米幼穗，用无菌水冲洗2-3遍后用75％的乙醇浸泡3min-5min，浸泡取出后用无菌水冲洗5遍，剥取幼胚后备用；

S3、将农杆菌细胞稀释到LB液体培养基中，使得含农杆菌细胞的LB培养基的OD₆₀₀为0.4-0.8，将玉米幼胚完全浸泡在LB培养基中，摇晃培养20min-30min；

S4、将玉米幼胚取出，并放置在MS培养基上，黑暗条件下培养2-3天后，再将在MS培养基上长势良好的玉米幼胚转移到新的MS培养基上，重复2-3次；

S5、将玉米幼胚移栽到营养土中，温室中培养；

S6、待玉米幼胚长成幼苗后，取玉米叶片并提取质粒后用PCR方法进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌感受态细胞的型号为EHA105，且农杆菌感受态细胞储藏在-80℃冰箱中，并且从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞后使其插入冰浴中30min，待其自然融化。

3.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述LB固体培养基的组成为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10g/L，pH值为7.2，LB液体培养基的组成为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH值为7.2。

4.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述MS培养基的组成成分为硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.6g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，硫酸镁0.37g/L，氯化钙4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，硫酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。

5.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述营养土的组成成分为花生壳8份、高粱根粉6份、米糠7份、玉米秸秆粉12份、海藻泥13份，豆饼2份、秸秆8份、稻草灰4份。

6.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述PCR检测法采用Taq酶对质粒进行插入基因的检测。