[发明专利]一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法

权利要求书

1.一种实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，其特征在于：利用近红外光谱检测分析技术与代谢流分析调控技术结合快速检测并反映出细胞代谢状态，根据检测结果对发酵过程做出即时调整，具体步骤如下：

(1)针对某种谷氨酸棒杆菌的发酵，在不同发酵条件下，进行多批次的发酵，在每一批发酵过程中按照周期密集地对发酵液样品进行采集；

(2)利用分析设备对样品中的底物和代谢产物含量进行精确测定，并以此数据为基础，建立近红外分析模型和细胞代谢流分析模型，将近红外分析模型和细胞代谢流分析模型分别与发酵控制设备偶联，用来对发酵过程进行控制和调整；

(3)对模型的预测能力进行检验，包括模型的灵敏度、准确度、及对于异常状态的预警能力；

(4)将近红外分析模型、细胞代谢流分析模型与发酵控制模型相关联，实现对发酵过程中细胞代谢状态的实时监控与调整。

2.根据权利要求1所述的实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，其特征在于：所述步骤(1)中周期为每30min一周期。

3.根据权利要求1所述的实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，其特征在于：所述步骤(2)中分析设备为近红外分析仪、高效液相色谱仪。

4.根据权利要求1所述的实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，其特征在于：所述步骤(3)中近红外分析模型的建立步骤如下：

(1)样品的采集：在谷氨酸棒杆菌发酵生产过程中，从发酵开始时，用10mL EP管收集发酵液样品，收集时间间隔为20-30min；将收集好的样品存放于-80℃保存，用于扫描近红外光谱以及测定发酵液中各代谢产物浓度；

(2)近红外光谱扫描：在2mm比色杯中加入1mL发酵液样品，在25℃左右室温下，波长范围833-2500nm处，利用Tensor 37近红外扫描仪对发酵液样品进行扫描，对发酵液样品的近红外光谱进行采集；

(3)近红外光谱前处理：对采集得到的发酵液样品近红外光谱进行预处理，利用OPUS7.0软件进行分析预处理，除去噪音等外部条件对光谱的影响；

(4)近红外校正模型的建立：采用偏最小二乘的方法建立谷氨酸棒杆菌发酵过程中各代谢产物浓度的校正模型；以交叉检验的方法作为模型的检验方法，此种检验方法适用于样品数量较少或适中的样品模型的建立；

模型处理过程中，以RMSECV值作为模型准确性的参考指标，RMSECV值越小，则该模型的准确性越高；RMSEP值则作为检验模型的参考指标用于完善所建立的预测模型，其值表示真实值与预测值之间的相近程度，数值越小则证明其预测能力越高；RPD同样是模型准确性和可靠性的参考指标，RPD值越大说明模型越好；所建模型的预测值与样品的实际值之间的关系用R²来表示，其值越接近1，说明所建模型的拟合度越好；

以A、B、C、D……代表发酵液中测定出的代谢产物，则根据上述近红外分析模型建立方法可以建立A、B、C、D……等多个近红外预测模型。

5.根据权利要求1所述的实时监测谷氨酸棒杆菌发酵过程的方法，其特征在于：所述步骤(3)中细胞代谢流分析模型的建立步骤如下：

(1)代谢网络的建立

建立代谢网络需基于以下原则或假设：a：细胞应处于稳定期或细胞浓度变化可以忽略；b：NADPH供需平衡，即反应消耗的NADPH总量与PPP、TCA循环产生的NADPH相等；c：大量“无效”循环的存在，ATP的消耗量和细胞维持的总能量并不相等，因此不考虑ATP总量的平衡；d：无分支点的中间反应及按照固定比例进行的反应，可简化为一个反应方程；

(2)代谢流计算

根据代谢产物各步酶促反应的化学计量平衡式和各代谢节点处的化合物平衡关系，构建该产物合成的代谢网络模型；根据模型所需代谢物速率，只需通过扫描近红外光谱，带入上述建立的近红外预测模型中，并从中选择各代谢物的浓度值，计算出其反应速率，带入到代谢流中就可算出整个合成途径代谢流量。