[发明专利]一种半乳糖-PEG-肌醇-PEI基因载体及其与基因组成的复合物和应用

说明书

本发明公开了一种半乳糖‑PEG‑肌醇‑PEI基因载体及其与基因组成的复合物和应用。本发明提供的半乳糖‑PEG‑肌醇‑PEI基因载体是由活化的肌醇与聚乙烯亚胺经一步反应得到肌醇‑聚乙烯亚胺，并进一步与PEG修饰的靶向配体结合，得到新的具有肝靶向作用的半乳糖‑PEG肌醇‑聚乙烯亚胺基因载体。该载体的生物相容性好，毒性低，基因转染效率高；此外，该载体具有肝靶向作用和免疫刺激作用，是一类适宜的肝部免疫基因治疗的载体。

技术领域

本发明属于基因药物载体技术领域，特别涉及半乳糖-PEG-肌醇-PEI基因载体及其与基因所组成的复合物，以及在制备治疗肝部疾病的免疫药物中的应用。

背景技术

免疫基因治疗是目前最有前景的研究方向之一，在各类疾病包括肝癌治疗方面均有明显疗效。除了治疗基因外，有效的基因载体是免疫基因治疗成功的关键。非病毒基因载体由于其较高安全性、易修饰性而受到广泛关注。

免疫治疗基因载体的合理设计需要考虑多种因素，包括载体的安全性、有效性、靶向能力及免疫佐剂作用等。聚乙烯亚胺(PEI25KD)是一类具有较高转染能力的聚阳离子基因载体，同时，PEI能刺激机体免疫反应。然而，高分子PEI转染效率高，毒性较大；而低分子量PEI毒性较低，却几乎不具有转染能力。肌醇为一类具有生理活性的物质。有研究报道，肌醇嫁接低分子量PEI能得到一类生物可降解高分子量基因载体，这类载体具有低毒高效的特点。PEG是一类中性亲水聚合物，将其嫁接到载体上能够改善载体的稳定性、降低其毒性并增强肿瘤被动靶向能力。然而，多个研究表明，PEG化后，由于对载体正电荷的屏蔽作用及立体位阻作用会降低载体的基因转染效率。而在载体上嫁接靶向基团能够使载体系统通过受体/配体介导的内吞作用增加PEG化载体的体内转染。

肝细胞及肝癌细胞表面高表达一类脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，ASGPR能特异性识别β-D-半乳糖残基。因此，在载体表面修饰半乳糖配体能使载体系统主动靶向至肝及肝癌细胞。除了靶向能力以外，半乳糖化糖蛋白能键合至巨噬细胞刺激机体免疫反应。因此，半乳糖化修饰能增加载体系统的免疫治疗能力。

发明内容

本发明提供了一种半乳糖-PEG-肌醇-PEI基因载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将肌醇、N,N’-羰基二咪唑、三乙胺溶于溶剂中，室温搅拌活化1-48h，将所得混合液滴入PEI溶液中，室温搅拌过夜，透析后冷冻干燥，得到白色絮状产物PEI-INO；

2)将乳糖酸、HATU与三乙胺溶于溶剂中，室温搅拌活化1-48h，将活化液滴入NH₂-PEG-COOH中，室温搅拌过夜，透析后冷冻干燥，得到白色絮状产物LA-PEG；将LA-PEG、HATU和三乙胺溶于溶剂中，室温搅拌活化，将活化液滴入PEI-INO中，室温搅拌过夜，透析后冷冻干燥，得到白色絮状产物，即为半乳糖-PEG-肌醇-PEI基因载体。

优选的，所述PEI包括线状或枝状聚乙烯亚胺；所述溶剂包括DMSO、水、乙醇或DMF中的至少一种。

优选的，所述肌醇与PEI的摩尔比为1:1-1:6；所述N,N’-羰基二咪唑与PEI的摩尔比为1:1-1:12。

优选的，所述乳糖酸与HATU的摩尔比为1:1-1:20；所述LA-PEG与HATU的摩尔比为1:1-1:20；所述LA-PEG与PEI-INO的摩尔比为0.01:1-10:1。

一种由上述方法制备得到的半乳糖-PEG-肌醇-PEI基因载体与基因所组成的复合物。

优选的，所述基因是DNA或RNA。

优选的，所述DNA包括报告基因、抗癌基因或细胞因子基因。

优选的，所述RNA包括siRNA，miRNA或piRNA。