[发明专利]一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌

说明书

本发明涉及一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，属于微生物以及基因工程技术领域。本发明以苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因为目的基因，以pBIG2‑ura5s‑ITs为表达载体，以高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株CCFM501为宿主菌株，通过根癌农杆菌介导的方法过表达PAH基因，构建了一种生产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其生产不饱和脂肪酸的能力可提升将近30％，且其对于产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，属于微生物以及基因工程技术领域。

背景技术

不饱和脂肪酸是指含有一个或多个双键的脂肪酸，其主要包含油酸、亚油酸、亚麻酸等，其中，油酸在工业应用中用途广泛，亚麻酸人体内不能自身合成，为必需脂肪酸对维持人体健康具有重要的作用。

现如今，人们因饮食习惯不当等原因，常缺乏不饱和脂肪酸的摄入，可导致生长迟缓、生殖障碍、皮肤损伤等问题，医药保健、工业应用等领域对于不饱和脂肪酸，特别是油酸、亚麻酸等的需求日益增加，因此，急需找到一种能够大量生产优质油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸的方法。

高山被孢霉是一种典型的产油丝状真菌，由于其产油能力显著，可作为多不饱和脂肪酸(PUFAs)的来源，然而高山被孢霉的产脂能力有限并受诸多因素影响，为提高高山被孢霉脂质合成的能力，并对其合成机理进行探究，可从分子水平对脂质合成相关基因进行遗传改造。

经研究，乙酰辅酶A和NADPH是脂肪合成的关键因素，脂肪酸的生成需要提供前体乙酰辅酶A以及还原力来源NADPH。

通常认为，磷酸戊糖途径和苹果酸酶是细胞内主要的NADPH来源；也有研究表明氨基酸代谢和脂质合成有重要关系，如亮氨酸和赖氨酸代谢、脯氨酸和谷氨酸代谢、丝氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等，其中，苯丙氨酸羟化酶(PAH)可催化苯丙氨酸反应生成酪氨酸，此步骤是苯丙氨酸代谢的限速反应，且最终可生成NADPH。

目前，动物体内的苯丙氨酸羟化系统已经完成了分子生物学鉴定，其包含以下要素：苯丙氨酸羟化酶(PAH；EC 1.14.16.1)、蝶啶甲醇胺脱水酶(PCD；EC 4.2.1.96)、二氢蝶啶还原酶(DHPR；EC 1.5.1.34)以及氧化辅助因子BH4和分子氧，其中，PAH及其辅助因子BH4可能与脂质代谢相关，人类PAH基因的突变可导致苯丙酮尿症(PKU)，PKU患者体内如AA和EPA等长链脂肪酸的含量会降低，而油酸的含量则升高。

王鸿超等前期对高山被孢霉进行了全基因组测序，并完成了高山被孢霉苯丙氨酸羟化系统的分子生物学鉴定，从分子水平上在真菌中证明了苯丙氨酸羟化系统的存在，并通过在培养基中添加PAH抑制剂，发现高山被孢霉的脂质合成能力下降；BH₄是NOS的辅助因子，张陈等人已证明BH₄代谢增强提高了高山被孢霉脂肪酸和NADPH含量的同时也增强了PAH基因的转录水平；本发明则选取PAH基因为研究对象，尝试提高高山被孢霉生产不饱和脂肪酸的能力，此研究对于产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明以苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因为目的基因，以pBIG2-ura5s-ITs为表达载体，以高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株CCFM501为宿主菌株，通过根癌农杆菌介导的方法过表达PAH基因，构建了一种生产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其生产不饱和脂肪酸的能力可提升将近30％，且其对于产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因；所述表达载体为pBIG2-ura5s-ITs；所述表达宿主为高山被孢霉。