[发明专利]一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）外源因子检测；

（2）脂肪干细胞的原代分离、培养和传代；

（3）间充质干细胞的鉴定；

（4）上清液的收集；

（5）冻干粉的制备；

（6）对上述上清液和冻干粉的干细胞活性因子进行检测；

（7）溶媒的配制和灌装；

步骤(2)中所述的脂肪干细胞的原代分离、培养和传代具体过程如下：首先将脂肪稀释，吹散后进行离心，小心抽取底部沉淀物，然后用消化液对抽取得到的底部沉淀物进行消化，接着再次离心，吸取细胞放入一次性培养皿中，并加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，5%的CO₂培养箱内进行培养，培养5天以后出现细胞集落，培养10-15天细胞密度达到80%左右时，进行传代；所述的消化液为浓度为0.1%-0.3%的胰蛋白酶或浓度为0.5%-2%的胶原酶。

2.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的外源因子检测具体过程如下：采用ELISA诊断试剂盒对吸取的脂肪组织上清液进行梅毒螺旋体、艾滋病病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、人巨细胞病毒、人EB病毒和T淋巴细胞白血病病毒等外源因子检测，从而确保脂肪组织中不含有以上外源因子。

3.根据权利要求2所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：传代过程中要用生理盐水清洗细胞表面两次，然后加入胰酶消化，进行离心和接种，再继续传代培养。

4.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的间充质干细胞的鉴定包括以下三个方面：a.标准培养条件下，在培养瓶或培养皿中能够贴壁生长；b.流式细胞仪检测结果显示细胞活率在90%以上，标志物CD90、CD105、CD73的阳性表达率在95%以上，标志物CD14、CD34、CD20、CD45的阴性表达率在5%以下，HLA-DR的表达率在2%以下；c.所述的间充质干细胞具有成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的潜能；以上三个方面的鉴定结果显示细胞符合间充质干细胞的标准。

5.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的上清液的收集是对P3-P5代次细胞上清液进行收集，当细胞生长到密度为70%-80%时收集上清液，然后补充到原来的体积再进行培养，待细胞长到致密单层时再次收集上清液。

6.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的冻干粉的制备过程具体如下：首先将冻干粉保护剂加入到收集到的上清液中，再通过0.22μm滤膜过滤除菌，将其分装到西林瓶中，半加塞，置冻干机中，按预定的冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，压塞后取出再进行压盖贴签即可；所述的冻干保护剂为甘露醇、右旋糖酐和蔗糖中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述的冻干具体流程如下：在-50℃的条件下预冷，之后抽真空，然后在-50℃保持6h，接着开始升温到-35℃保持20h，逐步升温到-20℃保持4h，0℃-10℃保持4h-6h，10℃-25℃保持4h，最后在25℃干燥6h。

8.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（6）中对所述的干细胞活性因子进行检测时，用2ml量的上清液冻干后的粉剂加4ml溶媒稀释，然后用EGF和bFGF试剂盒测定干细胞活性因子的含量。

9.根据权利要求1所述的干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤（7）中所述的溶媒是采用甘油和不同分子量的玻尿酸进行配制而成的，将其分装到西林瓶中进行压塞压盖贴签；配制溶媒的玻尿酸采用高、中、低分子量的玻尿酸进行不同比例配比。