[发明专利]检测双酚B的胶体金免疫层析检测卡及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测双酚B的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡上设有顺次搭接粘贴在底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

所述胶体金结合垫上吸附有胶体金标记的抗双酚B单克隆抗体；

所述硝酸纤维素膜上由样品垫端至吸水垫端依次设有检测线与质控线，所述检测线包被有双酚B-载体蛋白偶联物，所述质控线包被有抗鼠二抗：

所述双酚B-载体蛋白偶联物通过以下方法制备得到：将0.24g双酚B、0.15g 3-溴丙胺、0.70g无水碳酸钾分散至20mL干燥丙酮中，加热回流反应8h，制得双酚B半抗原，将纯化后的双酚B半抗原、N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加于烧杯中，加入3mL二甲基亚砜溶解，磁力搅拌过夜，然后称取0.12g载体蛋白，溶解在5mLpH7.0的0.1mol/LNaHCO₃中，得载体蛋白溶液，将含有双酚B半抗原的溶液加入上述载体蛋白溶液中，边搅拌边缓慢滴加，反应过夜，所得溶液4℃透析3天，即得；

所述抗双酚B单克隆抗体通过以下方法制备得到：

(A)动物免疫：取上述双酚B-载体蛋白偶联物，与弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫6-8周龄的雌性Balb/C小鼠，免疫后断尾取血测定效价，选择结果最佳的小鼠准备融合；

(B)细胞融合：取经选定小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，以HAT培养基筛选融合的细胞，用间接ELISA法测定上清液进行阳性筛选，筛选出稳定分泌抗双酚B的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(C)抗体制备：取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后，注射入Balb/C小鼠腹腔，抽取腹水，通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，并以亲和层析法得到纯化的抗双酚B-单克隆抗体；

所述胶体金标记的抗双酚B单克隆抗体通过以下方法制备得到：

(A)胶体金溶液制备：在水中加入柠檬酸三钠，煮沸后加入氯金酸，继续搅拌加热，当溶液的颜色变为透明的紫红色后停止加热，补水至原体积，冷却，保存备用；

(B)胶体金标记物的制备：取已制备好的胶体金溶液40mL，用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至8.2；取等量抗双酚B单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清；将所得沉淀用含2％BSA、0.1％叠氮钠的pH7.4的PBS缓冲液溶解稀释，即获得胶体金标记的抗双酚B单克隆抗体；

所述胶体金标记的抗双酚B单克隆抗体的浓度为40-80μg/ml，在检测卡上的用量为4-6μL/cm；

所述检测线包被的双酚B-载体蛋白偶联物的浓度为0.1-0.3μg/ml，在检测卡上的用量为0.5-1.5μL/cm；

所述质控线包被的抗鼠二抗的浓度为0.1-0.3mg/ml，在检测卡上的用量为0.5-1.5μL/cm。

2.根据权利要求1所述的检测双酚B的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测卡样品垫端和吸水垫端还分别设有样品端保护膜和手柄端保护膜，所述样品端保护膜覆盖样品垫、胶体金结合垫、以及硝酸纤维素膜与所述胶体金结合垫搭接端，所述手柄端保护膜覆盖吸水垫、以及硝酸纤维素膜与所述吸水垫搭接端。

3.根据权利要求2所述的检测双酚B的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述底板为PVC条；

所述样品垫和胶体金结合垫由玻璃纤维棉制成；

所述吸水垫由吸水滤纸制成；

所述保护膜为不透明的胶膜。

4.根据权利要求1所述的检测双酚B的胶体金免疫层析检测卡，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgG抗体、兔抗鼠IgG抗体或驴抗鼠IgG抗体。